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マルチローカスシーケンスタイピング（MLST ）は、分子生物学における複数の遺伝子座のタイピング技術であり、複数のハウスキーピング遺伝子の内部断片のDNA配列を用いて、異なる種の分離株を特徴づける。この技術は、他の方法では区別が難しい傾向にある微生物、特に原核生物や酵母に最も一般的に適用される。
最初に開発されたMLSTスキームは、髄膜炎菌性髄膜炎および敗血症の原因菌である髄膜炎菌（ Neisseria meningitidis）[ 1 ]のためのものでした。進化史の研究に導入されて以来、MLSTはヒト病原体だけでなく植物病原体にも使用されています。[ 2 ]
MLSTは、一連のハウスキーピング遺伝子におけるDNA配列の変異を直接測定し、固有のアレルプロファイルによって菌株を特徴づける手法です。MLSTの原理は単純で、PCR増幅とそれに続くDNAシーケンス解析によって行われます。菌株間のヌクレオチドの違いは、必要な識別度に応じて、様々な数の遺伝子で調べることができます。
MLSTのワークフローは、1) データ収集、2) データ解析、3) マルチローカスシーケンス解析から構成されます。データ収集ステップでは、遺伝子断片のヌクレオチド配列決定により、変異の明確な同定が行われます。データ解析ステップでは、すべての固有配列にアレル番号が割り当てられ、アレルプロファイルにまとめられ、シーケンスタイプ（ST）が割り当てられます。新しいアレルとSTが見つかった場合は、検証後にデータベースに保存されます。MLSTの最終解析ステップでは、アレルプロファイルを比較することにより、分離株の関連性が決定されます。研究者は、異なるクローン複合体のSTを比較することにより、疫学的および系統発生学的研究を行います。シーケンスおよび同定プロセス中に膨大なデータセットが生成されるため、バイオインフォマティクス技術を使用して、すべての生物学的データを整理、管理、分析、および統合します。
菌株タイピングにおける許容可能な同定能力、時間、コストのバランスを取るため、研究室では一般的に7～8個のハウスキーピング遺伝子が用いられます。黄色ブドウ球菌を例にとると、MLSTタイピングでは7個のハウスキーピング遺伝子が使用されます。これらの遺伝子には、MLSTウェブサイトで指定されているように、カルバメートキナーゼ（arcC）、シキミ酸デヒドロゲナーゼ（aroE）、グリセロールキナーゼ（glpF ） 、グアニル酸キナーゼ（gmk）、リン酸アセチルトランスフェラーゼ（pta ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ tpi）、アセチルCoAアセチルトランスフェラーゼ（yqiL）が含まれます。ただし、最大10個のハウスキーピング遺伝子が使用されることも珍しくありません。Vibrio vulnificusの場合、使用されるハウスキーピング遺伝子は、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ（glp）、DNAジャイレースサブユニットB（gyrB）、リンゴ酸-乳酸デヒドロゲナーゼ（mdh）、メチオニルtRNAシンテターゼ（metG）、ホスホリボシルアミノイミダゾールシンテターゼ（purM）、トレオニンデヒドロゲナーゼ（dtdS）、ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ（lysA）、トランスヒドロゲナーゼαサブユニット（pntA）、ジヒドロオロターゼ（pyrC）、およびトリプトファナーゼ（tnaA）です。したがって、MLSTによって調べられるハウスキーピング遺伝子の数と種類は、種によって異なる場合があります。
これらのハウスキーピング遺伝子それぞれについて、異なる配列は対立遺伝子として割り当てられ、遺伝子座の対立遺伝子によって対立遺伝子プロファイルが提供されます。一連のプロファイルは、株の型別識別マーカーとして使用できます。1つのヌクレオチドでも異なる配列は異なる対立遺伝子として割り当てられ、対立遺伝子間のヌクレオチドの違いの数を考慮するための重み付けは行われません。これは、複数のヌクレオチド部位の違いが複数の点突然変異の結果なのか、単一の組換え交換の結果なのかを区別できないためです。各遺伝子座には多数の潜在的な対立遺伝子が存在するため、数十億もの異なる対立遺伝子プロファイルを区別することが可能であり、各遺伝子座で最も一般的な対立遺伝子を持つ株は、約10,000株に1回程度しか偶然に出現しないと予想されます。MLSTは高い識別力を持つにもかかわらず、ハウスキーピング遺伝子におけるヌクレオチド変化の蓄積は比較的ゆっくりとしたプロセスであり、細菌分離株の対立遺伝子プロファイル は時間的に十分に安定しているため、この方法は世界的な疫学調査に最適です。
分離株の関連性は、それらの対立遺伝子プロファイル間のペアワイズ差のマトリックス、eBURST、または最小全域木（MST）を使用して構築されたデンドログラムとして表示されます。デンドログラムは、共通の祖先から派生したと考えられる、同一または非常に類似した対立遺伝子プロファイルを持つ分離株を表示する便利な方法にすぎません。7つの遺伝子座のうち3つ以上で異なる分離株間の関係は信頼性が低い可能性が高く、それらの系統発生を推測するために使用すべきではありません。[ 3 ] [ 4 ] MSTは、ツリーのすべての枝の合計距離が最小になるようにすべてのサンプルを接続します。[ 5 ]
あるいは、分離株の関連性は、マルチローカス配列解析（MLSA）。これは割り当てられた対立遺伝子を使用せず、代わりにハウスキーピング遺伝子の遺伝子断片の配列を連結し、この連結された配列を使用して系統関係を決定します。MLSTとは対照的に、この解析では、1つのヌクレオチドのみが異なる配列間にはより高い類似性を割り当て、複数のヌクレオチドの違いがある配列間にはより低い類似性を割り当てます。その結果、この解析はクローン進化する生物に適しており、組換えイベントが非常に頻繁に発生する生物にはあまり適していません。また、近縁種間の系統関係を決定するためにも使用できます。[ 6 ] MLSTとMLSAという用語は、非常によく互換性があると見なされます。しかし、これは正しくありません。各解析方法には独自の特徴と用途があります。正しい用語を使用するように注意する必要があります。
以前は細菌分離株を識別するために血清学的タイピング法が確立されていましたが、免疫学的タイピングには、少数の抗原遺伝子座への依存や、異なる抗原変異体に対する抗体の反応性の予測不可能性などの欠点があります。パルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）、リボタイピング、PCRベースのフィンガープリンティングなど、病原体の関連性を決定するためにいくつかの分子タイピング法が提案されています。しかし、これらのDNAバンドベースのサブタイピング法では、意味のある進化的解析は得られません。PFGEは多くの研究者によって「ゴールドスタンダード」と考えられていますが、プロセス中にDNAが分解されるため（ゲルスメア）、この技術では多くの株をタイピングできません。
MLSTのアプローチは、複数のコア代謝酵素の異なる電気泳動移動度（EM）に基づくマルチローカス酵素電気泳動（MLEE）とは異なります。各遺伝子座の対立遺伝子は、その産物のEMを決定します。酵素間のアミノ酸配列が異なると、ゲル上で泳動したときに異なる移動度と明確なバンドが生じます。分離株の関連性は、電気泳動タイプのペアワイズ差のマトリックスから生成されたデンドログラムで視覚化できます。この方法は、酵素表現型の多様性がDNA配列の多様性の単なる代理指標であるという事実から生じるいくつかの理由により、MLSTよりも解像度が低くなります。第一に、酵素は、明確なバンドを生じるほど十分に異なるEMを持たずに、異なるアミノ酸配列を持つ場合があります。第二に、「サイレント変異」は、コードされるアミノ酸を変化させることなく、遺伝子のDNA配列を変化させる可能性があります。第三に、酵素の表現型は環境条件に応じて容易に変化し、MLEEの結果の再現性に悪影響を及ぼす可能性があります。酵素の一般的な変化としては、リン酸化、補因子結合、輸送配列の切断などが挙げられます。これは、異なる研究室で得られたMLEEデータの比較可能性を制限する要因にもなります。一方、MLSTは持ち運び可能で比較可能なDNA配列データを提供し、自動化と標準化の大きな可能性を秘めています。
MLSTは、生物の集団を区別するために部分的な遺伝情報を使用しようとする点でDNAバーコーディングと似ています。ただし、DNAバーコーディングは種を区別することを目的としており、比較的変異率の速い1つまたは2つの短い断片（mtDNAまたはrDNAの断片など）の使用を好みます。これらの断片は通常、種間で配列に大きな違いをもたらします。そうでない場合は、複数の遺伝子座が使用されることがありますが[ 7 ]、MLSTとは異なり、焦点は種レベルにとどまります[ 8 ] 。
MLSTは非常に明確で汎用性が高い。ST判定に必要な材料は研究室間で交換可能。プライマー配列とプロトコルは電子的にアクセスできる。再現性と拡張性に優れている。MLSTは自動化されており、ハイスループットシーケンスとバイオインフォマティクスの進歩と確立された集団遺伝学技術を組み合わせている。MLSTデータは細菌間の進化関係を調査するために使用できる。MLSTは分離株を識別する優れた識別力を提供する。
MLSTの応用範囲は非常に広く、科学、公衆衛生、獣医学分野だけでなく、食品業界にとっても貴重な情報源となっている。以下に、MLSTの応用例をいくつか示す。
カンピロバクターは、通常、加熱不十分な鶏肉や未殺菌の牛乳から発生する細菌性腸管感染症の一般的な原因菌です。しかし、アウトブレイクがまれにしか検出されないため、その疫学は十分に理解されておらず、アウトブレイクの発生源や感染経路を容易に追跡できません。さらに、カンピロバクターのゲノムは遺伝的に多様で不安定であり、ゲノム内およびゲノム間の組換えが頻繁に起こり、相変異も伴うため、多くのタイピング方法からのデータの解釈が複雑になります。最近まで、MLST技術の適用により、カンピロバクターのタイピングは大きな成功を収め、MLSTデータベースに追加されました。2008年5月1日現在、カンピロバクターMLSTデータベースには3516の分離株と、カンピロバクターの研究でMLSTを使用または言及している約30の論文が含まれています（ http://pubmlst.org/campylobacter/）。
MLSTは、ヒト集団内の細菌や、ヒト、植物、動物に病原性を持つ可能性のある株変異体について、より詳細な情報を提供してきました。MLST技術は、Maidenら（1）によって初めて6つの遺伝子座を用いて髄膜炎菌を特徴づけるために使用されました。MLSTの適用により、世界中で侵襲性疾患の原因となっている主要な髄膜炎菌系統が明確に解明されました。主要な侵襲性系統間の識別力を向上させるために、現在では7つの遺伝子座が使用されており、多くの研究室で髄膜炎菌分離株の特徴づけのための最適な方法として受け入れられています。N . meningitidisでは組換え交換が頻繁に起こり、髄膜炎菌クローンの急速な多様化につながることはよく知られています[ 9 ]。MLSTは、クローン多様化の速度が一般的に低い他の細菌種内のクローンの特徴づけに信頼できる方法を提供することに成功しました。
黄色ブドウ球菌（ S. aureus）は多くの疾患を引き起こします。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ MRSA）は、バンコマイシンを除くほぼすべての抗生物質に対する耐性により、ますます懸念が高まっています。しかし、地域社会における重篤な黄色ブドウ球菌感染症のほとんど、そして病院における多くの感染症は、メチシリン感受性分離株（MSSA）によって引き起こされており、重篤な疾患に関連する高病原性MSSAクローンを特定しようとする試みはほとんどありませんでした。そこで、MRSAクローンを明確に特徴づけ、重篤な疾患に関連するMSSAクローンを特定するための方法として、MLSTが開発されました。
S. pyogenes は、咽頭炎から壊死性筋膜炎を含む生命を脅かす膿痂疹まで、さまざまな疾患を引き起こします。S . pyogenesの MLST スキームが開発されました。現在、データベース ( mlst.net ) [ 10 ]には、この生物の世界的な多様性と深刻な侵襲性疾患からの分離株を代表する分離株の対立遺伝子プロファイルが含まれています。 [ 11 ]
カンジダ・アルビカンスはヒトの真菌病原体であり、院内感染による血流感染症の原因菌です。MLST法はカンジダ・アルビカンス分離株の特性解析に用いられてきました。異なる遺伝子座の対立遺伝子の組み合わせによって、株を識別するために使用できる固有の二倍体配列型が生成されます。MLST法は、病院におけるカンジダ・アルビカンスの疫学研究や、ヒトや動物宿主を含む多様な生態環境から得られたカンジダ・アルビカンス分離株の多様性の研究に有効であることが示されています。
Cronobacter属は7種から構成されています。2007年以前は、これらの生物にはEnterobacter sakazakiiという単一の種名が適用されていました。16S rDNA配列決定は必ずしも十分正確ではなく、バイオタイピングは主観的すぎるため、C. sakazakiiとC. malonaticusを区別するために、当初Cronobacter MLSTが適用されました。 [ 12 ] Cronobacter MLSTスキームは、atpD、fusA、glnS、gltB、gyrB、infB、ppsAの7つの対立遺伝子を使用し、系統解析（MLSA）および比較ゲノミクス用に3036 bpの連結配列を提供します。[ 13 ] MLSTは、新しいCronobacter種 の正式な認識にも使用されています。[ 14 ]この方法により、1 つの遺伝子系統であるシーケンス タイプ 4 (ST4) と新生児髄膜炎の症例との間に強い関連性があることが明らかになった。[ 15 ] Cronobacter MLST サイトはhttp://www.pubMLST.org/cronobacterにある。
MLSTは集団遺伝学的研究において最も優れているように見えるが、高価である。ハウスキーピング遺伝子の配列保存性のため、MLSTは細菌株を識別する識別力に欠ける場合があり、疫学的調査での使用が制限される。MLSTの識別力を向上させるために、リステリア・モノサイトゲネスを用いて多病原性遺伝子座配列タイピング（MVLST）アプローチが開発された。[ 16 ] MVLSTはMLSTの利点を広げるが、ハウスキーピング遺伝子よりも多型性が高い可能性のある病原性遺伝子を標的とする。集団遺伝学は流行における唯一の関連要因ではない。病原性因子も病気を引き起こす上で重要であり、集団遺伝学的研究ではこれらを監視するのが難しい。これは、関連する遺伝子が集団遺伝学的枠組みと比較して、株間で高度に組換えおよび移動していることが多いためである。したがって、たとえば大腸菌では、蔓延している株の集団遺伝学に基づく評価よりも、毒素遺伝子を持つ株を特定することの方が重要である。
第二世代シーケンス技術の出現により、比較的低コストで細菌ゲノム全体の配列情報を取得することが可能になり、MLST が最初に開発されたときのように各遺伝子座を個別にシーケンスするのではなく、全ゲノム配列情報から MLST を割り当てることができるようになりました。[ 17 ] 全ゲノムシーケンスは、細菌株を区別するためのより豊富な情報を提供します (MLST は、細菌ゲノムの残りの部分を無視して、ゲノム配列の約 0.1% を使用してタイプを割り当てます)。たとえば、多数の分離株の全ゲノムシーケンスにより、Klebsiella pneumoniaeの単一の MLST 系統 ST258が 2 つの異なる遺伝的クレードから構成されていることが明らかになり、[ 18 ]これらの多剤耐性菌の進化と拡散に関する追加情報を提供し、ST258 の単一のクローン起源という以前の仮説を否定しました。[ 19 ]
MLSTデータベースには、各生物種の参照アレル配列と配列型、および分離疫学データが含まれています。ウェブサイトには、ユーザーが自身のアレル配列と配列型を照会できる検索・解析ソフトウェアが搭載されています。MLSTは、研究者や公衆衛生従事者にとって広く利用されているツールです。
MLSTデータベースの大部分は、現在オックスフォード大学にあるウェブサーバー（pubmlst.org）でホストされています。
このサイトに掲載されているデータベースには、生物種固有の参照アレル配列と、個々の生物種のST（配列タイプ）リストが格納されている。
利用されるシーケンスの収集とフォーマットを支援するために、Firefox 用のシンプルで無料のプラグインが開発されました (リンク2014-02-22 にWayback Machineにアーカイブ済み)。
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