大規模並列シーケンス

大規模並列シーケンシングまたは超並列シーケンシングは、大規模並列処理の概念を使用したDNA シーケンシングに対するいくつかの高スループット手法のいずれかです。次世代シーケンシング( NGS ) または第二世代シーケンシングとも呼ばれます。これらの技術の一部は 1993 年から 1998 年の間に登場し^{[1] [2] [3] [4] [5]}、2005 年から市販されています。これらの技術では、小型化および並列化されたプラットフォームを使用して、機器の実行ごとに 100 万から 430 億の短い読み取り (それぞれ 50 から 400 塩基) をシーケンシングします。

多くのNGSプラットフォームは、エンジニアリング構成とシーケンシング化学が異なります。それらは、空間的に分離されたクローン増幅DNAテンプレートまたはフローセル内の単一のDNA分子を介して、大規模な並列シーケンシングという技術的パラダイムを共有しています。この設計は、個々のシーケンシング反応で生成された連鎖終結産物の電気泳動分離に基づくサンガーシーケンシング（キャピラリーシーケンシングまたは第一世代シーケンシングとも呼ばれる）とは大きく異なります。 ^[6]この方法論により、より大規模なシーケンシングが可能になります。^[7]

市販のNGSプラットフォームによるDNAシーケンシングは、一般的に以下の手順で行われる。まず、PCRによるクローン増幅によってDNAシーケンシングライブラリが in vitroで生成される。次に、DNAは合成によってシーケンシングされ、DNA配列は連鎖停止化学反応ではなく相補鎖へのヌクレオチドの付加によって決定される。最後に、空間的に分離された増幅DNAテンプレートは、物理的な分離ステップを必要とせずに、大規模に並列的に同時にシーケンシングされる。これらの手順はほとんどのNGSプラットフォームで実行されるが、それぞれ異なる戦略が利用されている。^[8]

NGSによるシーケンシング反応の並列化により、1回の機器実行で数百メガベースからギガベースのヌクレオチド配列読み取りが生成されます。これにより、利用可能な配列データが大幅に増加し、生物医学におけるゲノムシーケンシングのアプローチが根本的に変化しました。^[9] 新たに登場したNGSテクノロジーと機器により、シーケンシングのコストが大幅に削減され、ゲノムシーケンシング1回あたり1000ドルに近づいています。^{[10] [11]}

2014 年現在、超並列シーケンシング プラットフォームが市販されており、その特徴は表にまとめられています。NGS 技術の進歩が急速に進むにつれ、技術仕様と価格は流動的になっています。

シングルエンドシーケンシングの実行時間と1回あたりのギガベース（Gb）出力が示されています。ペアエンドシーケンシングを実行すると、実行時間と出力は約2倍になります。‡Roche 454およびHelicos Biosciencesプラットフォームの平均読み取り長。^[23]

NGS 反応のテンプレートを準備するには、単一 DNA 分子から増幅されたテンプレートと単一 DNA 分子テンプレートの 2 つの方法が使用されます。単一の蛍光イベントを検出できないイメージング システムでは、DNA テンプレートの増幅が必要です。最も一般的な 3 つの増幅方法は、エマルジョン PCR (emPCR)、ローリング サークル、および固相増幅です。テンプレートの最終的な分布は、空間的にランダムまたはグリッド上にすることができます。

エマルジョン PCR法では、まずゲノムDNAをランダムに断片化してDNAライブラリを生成します。一本鎖DNA断片（テンプレート）をアダプターまたはリンカーでビーズの表面に取り付け、ビーズ1つをDNAライブラリのDNA断片1つに取り付けます。ビーズの表面には、DNA断片に結合するアダプターと相補的な配列を持つオリゴヌクレオチドプローブが含まれています。ビーズはその後、水油エマルジョン液滴に区画化されます。水性水油エマルジョンでは、1つのビーズを捕捉する液滴のそれぞれがPCRマイクロリアクターであり、単一のDNAテンプレートの増幅コピーを生成します。^{[24] [25] [26]}

溶液中でのローリングサークル増幅によって単一DNA分子の集団を増幅し、続いて固定化されるDNAよりも小さいサイズのスポットのグリッド上に捕捉する。^{[27] [28] [29] [30]} MGI TechのDNBSEQやElement BiosciencesのAVITIなどの第2世代シーケンシング技術では、このアプローチを使用してフローセル上のサンプルを準備し、サイクルごとに画像化します。

フローセル内のスライドには、フォワードプライマーとリバースプライマーが高密度で共有結合しています。プライマーとサポート上のテンプレートの比率によって、増幅されたクラスターの表面密度が決まります。フローセルはポリメラーゼベースの伸長試薬にさらされ、連結されたフラグメントの自由端/遠位端が表面の相補オリゴに「橋渡し」されるときにプライミングが行われます。変性と伸長を繰り返すと、フローセル表面の何百万もの別々の場所で DNA フラグメントが局所的に増幅されます。固相増幅によって、空間的に分離された 1 億～ 2 億のテンプレート クラスターが生成され、自由端が提供され、ユニバーサル シーケンシング プライマーがハイブリダイズされてシーケンシング反応が開始されます。^{[24] [25]}この技術は、1997年にグラクソ・ウェルカムのジュネーブ生物医学研究所（GBRI）のパスカル・メイヤー、エリック・カワシマ、ローラン・ファリネッリによって特許出願され、^{[4] [5]} 1998年に初めて公開されました。^[31] 1994年にクリス・アダムスとスティーブ・クロンが、類似しているがクローンではない表面増幅法の特許を出願し、「ブリッジ増幅」と名付けました。^[3]これは、 1997年にチャーチとミトラによってクローン増幅に適応されました。^{[27] [28]}

DNA 増幅を必要とするプロトコルは、実装が面倒な場合が多く、シーケンシング エラーを引き起こす可能性があります。単一分子テンプレートの調製はより簡単で、増幅されたテンプレートにエラーを引き起こす可能性のある PCR を必要としません。AT リッチおよび GC リッチのターゲット シーケンスは、増幅バイアスを示すことが多く、その結果、ゲノム アラインメントおよびアセンブリでそれらのシーケンスが過小評価されます。単一分子テンプレートは通常、少なくとも 3 つの異なるアプローチのいずれかを使用して固体支持体に固定されます。最初のアプローチでは、空間的に分散した個々のプライマー分子が固体支持体に共有結合されます。テンプレートは、開始材料をランダムに小さなサイズ (たとえば、約 200～250 bp) に断片化し、断片の末端に共通のアダプターを追加することによって準備され、次に固定されたプライマーにハイブリダイズされます。2 番目のアプローチでは、空間的に分散した単一分子テンプレートは、固定されたプライマーから一本鎖の単一分子テンプレートをプライミングおよび伸長することによって固体支持体に共有結合されます。次に、共通のプライマーがテンプレートにハイブリダイズされます。どちらのアプローチでも、DNA ポリメラーゼは固定されたプライムされたテンプレート構成に結合して NGS 反応を開始できます。Helicos BioSciences は、上記の両方のアプローチを使用しています。3 番目のアプローチでは、空間的に分散された単一のポリメラーゼ分子が固体支持体に取り付けられ、プライムされたテンプレート分子が結合されます。このアプローチは Pacific Biosciences が使用しています。この技術では、より大きな DNA 分子 (最大数万塩基対) を使用できます。また、最初の 2 つのアプローチとは異なり、3 番目のアプローチはリアルタイム メソッドで使用できるため、読み取り長が長くなる可能性があります。

合成によるシーケンシャルシーケンシング（SBS）の目的は、DNAポリメラーゼによるヌクレオチドの取り込みを検出することでDNAサンプルの配列を決定することです。人工ポリメラーゼを使用して一本鎖DNAのコピーを合成し、各ヌクレオチドの取り込みを監視します。合成によるシーケンシングの原理は1993年に初めて説明され^[1]、数年後に改良版が公開されました。^[32]主要な部分はSBSのすべての実施形態で非常に類似しており、（1）後続のシグナルを強化し、配列決定するDNAを固体支持体に付着させるためのDNAの増幅、（2）固体支持体上での一本鎖DNAの生成、（3）人工ポリメラーゼを使用したヌクレオチドの取り込み、および（4）ヌクレオチドの取り込みの検出が含まれます。次に、ステップ 3 ～ 4 を繰り返し、ステップ 4 で取得した信号からシーケンスを組み立てます。この合成によるシーケンスの原理は、454、PacBio、IonTorrent、Illumina、MGIなど、ほぼすべての大規模並列シーケンス機器で使用されています。

パイロシーケンシングの原理は、固体支持体と、3'から5'エキソヌクレアーゼ活性を欠いた人工DNAポリメラーゼ（校正）と、ホタルルシフェラーゼを使用した発光リアルタイム検出を組み合わせることで^、 1993年に初めて説明されました[1]。合成によるシーケンシングのすべての主要な概念が導入され、これには（1）後続のシグナルを増強し、配列決定するDNA（テンプレート）を固体支持体に付着させるDNAの増幅、（2）固体支持体上での一本鎖DNAの生成、（3）人工ポリメラーゼを使用したヌクレオチドの組み込み、および（4）組み込まれたヌクレオチドのリアルタイムの光検出による検出が含まれます。後続の論文^[2]では、この概念がさらに発展し、1998年に論文^[32]が発表され、著者らは、組み込まれなかったヌクレオチドを4番目の酵素（アピラーゼ）で除去することで、組み込まれなかったヌクレオチドを洗い流す必要なく合成による配列決定を行うことができることを示しました。

このアプローチでは、可逆的なターミネーター結合dNTPを、ヌクレオチドの取り込み、蛍光イメージング、切断からなる循環法で使用します。蛍光標識ターミネーターは、dNTPが追加されるたびにイメージングされ、次に切断されて次の塩基の取り込みが可能になります。これらのヌクレオチドは化学的にブロックされているため、各取り込みは固有のイベントです。各塩基取り込みステップの後にイメージングステップが続き、次にブロックされたグループが化学的に除去されて、各鎖がDNAポリメラーゼによる次の取り込みに備えられます。この一連のステップは、ユーザー定義の機器設定によって決定される特定のサイクル数だけ継続されます。3'ブロッキンググループは、もともと酵素的^[33]または化学的逆転^{[14]として考えられていました[15]。}化学的方法は、SolexaおよびIlluminaマシンの基礎となっています。可逆的ターミネーター化学によるシーケンシングは、イルミナ/ソレクサが使用する4色サイクル、またはヘリコスバイオサイエンスが使用する1色サイクルである。ヘリコスバイオサイエンスは、阻害剤として機能する第2のヌクレオシド類似体を備えたブロックされていないターミネーターである「仮想ターミネーター」を使用した。これらのターミネーターには、DNA合成が1塩基追加後に終了するように、グループを終了または阻害するための適切な修飾が施されている。^{[25] [34] [35]}

このアプローチでは、配列伸長反応はポリメラーゼではなく、DNAリガーゼと1塩基コード化プローブまたは2塩基コード化プローブによって行われます。最も単純な形式では、蛍光標識プローブがプライミングされたテンプレートに隣接する相補配列にハイブリダイズします。次にDNAリガーゼを加えて、染料標識プローブをプライマーに結合します。ライゲーションされていないプローブを洗い流し、続いて蛍光イメージングを行ってライゲーションされたプローブの正体を確認します。このサイクルは、切断可能なプローブを使用して蛍光染料を除去し、次のライゲーションサイクルのために5′-PO4基を再生するか（連鎖ライゲーション^{[16] [36]}）、または除去して新しいプライマーをテンプレートにハイブリダイズするか（非連鎖ライゲーション^{[18] [19]}）のいずれかによって繰り返すことができます。

現在、この方法をリードしているのはパシフィックバイオサイエンスです。リアルタイムシーケンシング法では、DNA合成中に染料標識ヌクレオチドが連続的に組み入れられる様子を画像化します。個々のゼロモード導波管検出器（Zmw検出器）の底面にDNAポリメラーゼ分子が取り付けられ、リン酸結合ヌクレオチドが成長するプライマー鎖に組み込まれる間に配列情報を取得できます。パシフィックバイオサイエンスは、リン酸結合ヌクレオチドをより適切に組み込み、閉じた環状テンプレートの再配列を可能にする独自のDNAポリメラーゼを使用しています。シングルリード精度は87％ですが、コンセンサス精度は数キロベースのリード長で99.999％であることが実証されています。^{[37] [38]} 2015年、パシフィックバイオサイエンスは、容量を約6.5倍に増やすSequel Systemと呼ばれる新しいシーケンシング機器をリリースしました。^{[39] [40]}

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