遺伝子ノックアウト

遺伝子ノックアウト（遺伝子欠失または遺伝子不活性化とも呼ばれる）は、生物のゲノム内の特定の遺伝子を標的として除去または不活性化する遺伝子工学技術として広く使用されています。これは、相同組み換え、CRISPR-Cas9、TALENなど、さまざまな方法で行うことができます。

遺伝子ノックアウトの主な利点の 1 つは、研究者が特定の遺伝子の機能を生体内で研究し、正常な発達や生理機能、および疾患の病理における遺伝子の役割を理解できることです。遺伝子がノックアウトされた生物の表現型を研究することで、研究者は遺伝子が関与する生物学的プロセスに関する洞察を得ることができます。

遺伝子ノックアウトには、完全ノックアウトと条件付きノックアウトの 2 つの主な種類があります。完全ノックアウトでは遺伝子が永久に不活性化されますが、条件付きノックアウトでは特定の時間または特定の組織で遺伝子のオン/オフを切り替えることができます。条件付きノックアウトは、発達過程の研究や、特定の細胞タイプまたは組織における遺伝子の役割の理解に特に役立ちます。

遺伝子ノックアウトは、細菌、酵母、ショウジョウバエ、ゼブラフィッシュ、マウスなど、さまざまな生物で広く使用されています。マウスでは、遺伝子ノックアウトは、発達、生理学、がん研究における特定の遺伝子の機能の研究によく使用されます。

マウスモデルにおける遺伝子ノックアウトの使用は、ヒトの疾患の研究において特に有益です。たとえば、マウスの遺伝子ノックアウトは、がん、神経疾患、免疫疾患、代謝疾患における特定の遺伝子の役割を研究するために使用されています。

しかし、遺伝子ノックアウトにもいくつかの制限があります。たとえば、単一の遺伝子の喪失では遺伝性疾患の影響を完全に再現できない可能性があり、ノックアウトによって他の遺伝子や経路に意図しない影響が生じる可能性があります。さらに、マウスのゲノムはヒトのゲノムと同一ではなく、マウスの生理機能はヒトの生理機能とは異なるため、遺伝子ノックアウトは必ずしもヒトの疾患の適切なモデルとは限りません。

KO 技術は、本質的には遺伝子ノックインの逆です。生物で 2 つの遺伝子を同時にノックアウトすることをダブル ノックアウト( DKO ) といいます。同様に、トリプル ノックアウト( TKO ) とクアドラプル ノックアウト( QKO )という用語は、それぞれ 3 つまたは 4 つのノックアウトされた遺伝子を表すために使用されます。ただし、ヘテロ接合 KO とホモ接合KOを区別する必要があります。前者では、2 つの遺伝子コピー (対立遺伝子)のうち 1 つだけがノックアウトされ、後者では両方がノックアウトされます。

ノックアウトはさまざまな技術によって実現されます。もともとは、自然に発生する突然変異を特定し、DNA配列決定やその他の方法によって遺伝子の喪失または不活性化を確立する必要がありました。^[1]

突然変異による遺伝子ノックアウトは、細菌では一般的に行われている。大腸菌でこの技術が使用された初期の例は、1989 年にハミルトンらによって発表された。^[2]この実験では、遺伝子を削除するために 2 つの連続した組み換えが使用された。この研究により、細菌の機能遺伝子を除去または置換する可能性が確立された。この方法はその後、他の生物、特にマウスなどの研究動物向けに開発されている。ノックアウト マウスは、疾患に重要な意味を持つ可能性のあるヒトの同等遺伝子を研究するためによく使用される。ノックアウト マウスを使用した研究の一例として、中国漢民族集団における原因不明の夜間突然死症候群 (SUNDS) とブルガダ症候群におけるXirpタンパク質の役割の調査がある。^[3]

遺伝子ノックアウトの研究では、遺伝子サイレンシングとしても知られる最近の手法であるRNA干渉（RNAi）が人気を集めています。RNA干渉（RNAi）では、特定の遺伝子のメッセンジャーRNAが、低分子干渉RNA（siRNA）またはショートヘアピンRNA（shRNA）を使用して不活性化されます。これにより、遺伝子の発現が効果的に停止します。Bcl-2やp53などのがん遺伝子、神経疾患、遺伝性疾患、ウイルス感染に関連する遺伝子はすべて、RNA干渉（RNAi）を利用した遺伝子サイレンシングのターゲットとなっています。^[4]

相同組換えとは、互いに同一の塩基配列の広範な領域を含む 2 本の DNA 鎖間での遺伝子の交換です。真核生物、細菌、および一部のウイルスでは、相同組換えは自然に発生し、遺伝子工学の有用なツールです。真核生物の減数分裂中に発生する相同組換えは、二本鎖 DNA 切断の修復に不可欠であり、染色体交差中に遺伝情報の移動を可能にすることで遺伝的変異を促進します。細菌における重要な DNA 修復メカニズムである相同組換えにより、遺伝子の水平移動と DNA への形質転換によって獲得した遺伝物質の挿入が可能になります。ウイルスにおける相同組換えは、ウイルスの進化の過程に影響を及ぼします。相同組換えは、遺伝子工学で使用される遺伝子ターゲティングの一種であり、特定の遺伝子の機能についてさらに知るために、その遺伝子に人工的な変異を導入します。この方法では、標的遺伝子に類似した配列を持ち、標的遺伝子の上流と下流で同じ配列に挟まれた外来 DNA を細胞に挿入します。細胞が類似の隣接領域を相同遺伝子として検出すると、複製中に標的遺伝子の DNA が外来 DNA 配列に置換されます。この置換により、標的遺伝子は「ノックアウト」されます。この技術を使用してマウスの胚性幹細胞の特定の対立遺伝子を標的とすることで、ノックアウト マウスを作成できます。遺伝子標的化の助けにより、多数のマウス遺伝子が停止され、癌、糖尿病、心血管疾患、神経疾患など、さまざまなヒト疾患の何百もの異なるマウス モデルが作成されました。^[要出典]マリオ カペッキ、マーティン J. エバンス卿、オリバー スミシーズは、マウス幹細胞の相同組換えに関する画期的な研究を行い、その研究結果により 2007 年のノーベル生理学・医学賞を共同受賞しました。^[5]伝統的に、相同組換えは遺伝子ノックアウトを引き起こす主な方法でした。この方法では、目的の変異を含むDNA構造を作成します。ノックアウトの目的では、通常、目的のノックアウト遺伝子の代わりに薬剤耐性マーカーを使用します。 ^[6]この構造には、ターゲット配列との相同性が最低2kb含まれます。この構造は、マイクロインジェクションまたはエレクトロポレーションのいずれかによって幹細胞に送達できます。この方法では、細胞自身の修復メカニズムを利用して、DNA構造を既存のDNAに組み換えます。これにより、遺伝子の配列が変更され、ほとんどの場合、遺伝子は翻訳されます。翻訳されたとしても、機能しないタンパク質に変換される。しかし、相同組換えはDNAの組み込みの10 ⁻²～ 10 ^{−3に過ぎないため、これは非効率的なプロセスである。 [6] [7]}多くの場合、構築物上の薬物選択マーカーは、組換えイベントが発生した細胞を選択するために使用される。

遺伝子が欠落したこれらの幹細胞は、マウスなどの初期胚に挿入することで体内で利用することができる。その結果得られたキメラマウスの生殖細胞に遺伝子変化が含まれていれば、子孫に受け継がれる可能性がある。^[6]

ほとんどの遺伝子に 2 つの対立遺伝子があり、同じ役割で協力するいくつかの関連遺伝子も含まれる可能性のある二倍体生物では、すべての標的遺伝子がノックアウトされるまで、追加の形質転換と選択が実行されます。ホモ接合ノックアウト動物を生成するには、選択的繁殖が必要になる場合があります。

現在、DNA配列を正確に標的にして二本鎖切断を引き起こす方法が3つ使用されています。これが起こると、細胞の修復機構は、多くの場合、切断された2つの末端を直接結合する非相同末端結合（NHEJ）を介して、この二本鎖切断を修復しようとします。^[7]これは不完全に行われる可能性があり、そのため塩基対の挿入または欠失を引き起こし、フレームシフト変異を引き起こします。これらの変異は、それが発生した遺伝子を機能不全にし、その遺伝子のノックアウトを作成します。このプロセスは相同組換えよりも効率的であるため、より簡単に二対立遺伝子ノックアウトを作成できます。^[7]

ジンクフィンガーヌクレアーゼは、DNA配列を正確に標的とすることができるDNA結合ドメインで構成されています。^[7]各ジンクフィンガーは目的のDNA配列のコドンを認識できるため、特定の配列に結合するようにモジュール式に組み立てることができます。^[9]これらの結合ドメインは、DNAの二本鎖切断（DSB）を引き起こすことができる制限エンドヌクレアーゼと結合しています。 ^[7]修復プロセスにより、遺伝子の機能を破壊する変異が導入されることがあります。^[要出典]

転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）にもDNA結合ドメインとDNAを切断できるヌクレアーゼが含まれています。^[10] DNA結合領域は、それぞれが目的の標的DNA配列の1つの塩基対を認識するアミノ酸の繰り返しで構成されています。^[9]この切断が遺伝子コード領域を標的とし、NHEJを介した修復によって挿入や欠失が導入されると、フレームシフト変異が発生することが多く、遺伝子の機能が損なわれます。^[10]

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) は、ゲノムの正確な編集を可能にする遺伝子工学技術です。CRISPR の応用例の 1 つは遺伝子ノックアウトで、生物内の特定の遺伝子を無効化または「ノックアウト」します。^{[引用が必要]}

CRISPR による遺伝子ノックアウトのプロセスには、ゲノム内の特定の場所をターゲットとするガイド RNA (gRNA) の設計、gRNA と Cas9 酵素 (分子ハサミとして機能) のターゲット細胞への送達、そして細胞が DNA の切断を修復できるようにするという 3 つの主なステップがあります。細胞が切断を修復すると、切断端が再び結合して機能しない遺伝子になるか、遺伝子の機能を破壊する突然変異が導入されるかのいずれかになります。

この技術は、細菌、酵母、植物、動物など、さまざまな生物に使用でき、科学者は特定の遺伝子の欠損による影響を観察することで、その遺伝子の機能を研究することができます。CRISPR ベースの遺伝子ノックアウトは、疾患の遺伝的基礎を理解し、新しい治療法を開発するための強力なツールです。

CRISPR ベースの遺伝子ノックアウトは、他の遺伝子工学技術と同様に、生物に対して意図しない、または有害な影響を及ぼす可能性があるため、注意して使用する必要があります。^{[9] [11]}結合した Cas9 は DNA の二本鎖切断を引き起こします。^[9]ジンクフィンガーや TALEN と同じ原理に従って、これらの二本鎖切断を修復しようとすると、フレームシフト変異が発生し、機能しない遺伝子が生じることがよくあります。^{[9]非侵襲性の CRISPR-Cas9 技術は、マウスのうつ病や不安に関連する遺伝子をノックアウトすることに成功しました。これは、}血液脳関門を通過して遺伝子改変を可能にした最初の成功した送達です。^[12]

遺伝子ノックインは遺伝子ノックアウトに似ていますが、遺伝子を削除するのではなく、別の遺伝子に置き換えます。^{[引用が必要]}

条件付き遺伝子ノックアウトは、組織特異的な方法で組織内の遺伝子の削除を可能にする。これは、ヌル突然変異が胚の死につながる場合、^[13]、または特定の組織または細胞タイプが特に興味深い場合に、遺伝子ノックアウトの代わりに必要となる。これは、遺伝子の周囲にloxP部位と呼ばれる短い配列を導入することによって行われる。これらの配列は、ノックアウトと同じメカニズムを介して生殖細胞系列に導入される。その後、この生殖細胞系列は、これらの配列を認識し、それらを組み換え、これらの部位に挟まれた遺伝子を削除できるウイルス酵素であるCreリコンビナーゼを含む別の生殖細胞系列と交配することができる。 ^[14]それ以来、他のリコンビナーゼが作成され、条件付きノックアウト実験に使用されている。^[15]

ノックアウトは主に、ノックアウト生物を同様の遺伝的背景を持つ野生型と比較することにより、特定の遺伝子またはDNA領域の役割を理解するために使用されます。^{[引用が必要]}

ノックアウト生物は、特定のノックアウトを使用して特定の生物学的プロセスまたは欠陥をターゲットにしたり、サッカロミセス・セレビシエなどのゲノム全体にわたるノックアウト生物のライブラリを使用して薬物の作用機序を理解したりするために、薬物開発におけるスクリーニングツールとしても使用されます。^[16]

• 必須遺伝子
• 遺伝子ノックダウン
• 条件付き遺伝子ノックアウト
• 生殖細胞系列
• 遺伝子サイレンシング
• ゲノム編集
• 計画的な絶滅
• 組み換え
• ミオスタチン
• ベルギーブルー

• 標的遺伝子置換の図
• Frontiers in Bioscience 遺伝子ノックアウト データベース (アーカイブのみで利用可能)
• 国際ノックアウトマウスコンソーシアム
• KOMP リポジトリ
• [1]
• [2]