同位体標識

安定同位体標識を用いた代謝フラックス解析（MFA）は、細胞内の代謝経路や反応における特定の元素のフラックスを説明する上で重要なツールである。同位体標識を細胞に与え、標識された餌を利用して細胞を増殖させる。定常代謝フラックス解析では、細胞が定常状態（細胞に出入りする同位体が時間とともに一定になる状態）または準定常状態（一定期間定常状態が維持される状態）に達する必要がある。^{[ 7 ]}出力代謝物の同位体パターンが決定される。出力同位体パターンは、各反応におけるフラックスの大きさ、反応物から生成物への変換速度を求めるために使用できる貴重な情報を提供する。^{[ 8 ]}

この図は、異なるラベルを使用して特定の反応における物質の流れを決定できることを示しています。元の代謝物である3炭素化合物が、1回の反応で2炭素代謝物と1炭素代謝物に分裂して再結合するか、または3炭素代謝物のままであると仮定します。反応に、代謝物の2つの同位体が等量で供給されるとします。1つは完全に標識されたもの（青い円）、一般に均一標識と呼ばれ、もう1つは完全に非標識のもの（白い円）です。図の左側の経路では代謝物に変化は見られませんが、右側では分裂と再結合が示されています。図に示すように、代謝物が左側の経路のみをたどる場合、均一標識代謝物と非標識代謝物の比率は50:50のままです。代謝物が右側の経路のみをたどる場合、すべて等量で新しい標識パターンが発生する可能性があります。元の代謝物が経路の左側と右側のどちらをたどるかによって、他の比率が発生する可能性があります。ここでは、代謝物の半分が左側に、残りの半分が右側に位置する場合の比率を示していますが、他の比率も起こり得ます。^{[ 9 ]} 1つの化合物中の標識原子と非標識原子のこれらのパターンは、同位体異性体を表しています。異なる標識の代謝物の同位体異性体分布を測定することにより、各反応を通るフラックスを決定できます。^{[ 10 ]}

MFAは、同位体標識から得られたデータと各反応の化学量論、制約、最適化手順を組み合わせてフラックスマップを解読します。 ir可逆反応は、フラックスを見つけるために必要な熱力学的制約を提供します。反応の化学量論を含むマトリックスが構築されます。細胞内フラックスは、シミュレーションされたフラックスを化学量論モデルに代入する反復法を使用して推定されます。シミュレーションされたフラックスは、各反応で反応物が生成物に変換される速度を示すフラックスマップに表示されます。^{[ 8 ]}ほとんどのフラックスマップでは、矢印が太いほど、反応のフラックス値が大きくなります。^{[ 11 ]}

同位体異性体間の違いを測定するあらゆる手法が使用可能である。安定同位体標識における質量同位体異性体の測定には、核磁気共鳴（NMR）法と質量分析法（MS）という2つの主要な手法が開発されている。

プロトンNMRは、 ^13C標識実験に最初に用いられた技術です。この方法を用いると、特定の代謝物プール内の各プロトン化炭素位置を他の位置とは別に観察することができます。^{[ 12 ]}これにより、その特定の位置で標識された同位体異性体の割合を知ることができます。プロトンNMRの限界は、代謝物にn個の炭素原子がある場合、位置ごとの濃縮値は最大でもn個しか存在できず、これは同位体異性体情報全体のほんの一部に過ぎないということです。プロトンNMR標識の使用には限界がありますが、純粋なプロトンNMR実験は、より多くの同位体異性体情報を含む実験よりも評価がはるかに容易です。

プロトン NMRに加えて¹³ C NMR技術を使用すると、同位体異性体の分布をより詳細に見ることができます。標識された炭素原子は、分子内の直接の隣接原子の標識状態に応じて、異なる超微細分裂信号を生成します。^{[ 12 ]}隣接する炭素原子が標識されていない場合は、一重線ピークが現れます。隣接する炭素原子が 1 つだけ標識されている場合は、二重線ピークが現れます。二重線の分裂の大きさは、隣接する炭素原子の官能基に依存します。隣接する炭素原子が 2 つ標識されている場合、二重線の分裂が等しい場合は、二重線の二重線が三重線に縮退する可能性があります。

代謝フラックス解析にNMR技術を用いる際の欠点は、他のNMR応用とは異なり、非常に専門的な分野である点です。NMR分光計は、すべての研究チームがすぐに利用できるとは限りません。NMR測定パラメータの最適化やピーク構造の適切な解析には、熟練したNMR専門家が必要です。また、特定の代謝物については、追加の同位体異性体データを取得するために、特殊な測定手順が必要となる場合もあります。さらに、ピーク面積の正確な量を決定し、絡み合った一重線、二重線、三重線ピークの分解を識別するためには、専用のソフトウェアツールが必要となります。

核磁気共鳴とは対照的に、質量分析法（MS）は代謝フラックス分析実験により適しており、感度も高い別の方法です。MS装置にはさまざまな種類があります。二次元核磁気共鳴（2D-NMR）とは異なり、MS装置は加水分解物と直接反応します。^{[ 12 ]}

ガスクロマトグラフィー質量分析法（GC-MS）では、質量分析計（MS）をガスクロマトグラフに接続し、加水分解物の化合物を分離します。GCカラムから溶出した化合物はイオン化され、同時にフラグメント化されます。GC-MSを使用する利点は、分子イオンの質量同位体だけでなく、複数のフラグメントの質量同位体スペクトルも測定できるため、測定情報が大幅に増加することです。

液体クロマトグラフィー質量分析法（LC-MS）では、GCの代わりに液体クロマトグラフが使用されます。^{[ 13 ]}主な違いは、化学誘導体化が不要であることです。ただし、MFAへのLC-MSの応用はまれです。

いずれの場合も、MS装置は特定の同位体分布をその分子量で割ります。同じ数の標識炭素原子を含む特定の代謝物のすべての同位体は、1つのピーク信号に収集されます。すべての同位体はMSスペクトルで正確に1つのピークに寄与するため、各ピークのパーセンテージ値を計算して、質量同位体分率を得ることができます。^{[ 12 ]} n個の炭素原子を持つ代謝物の場合、n+1個の測定値が生成されます。正規化後、正確にn個の情報のある質量同位体量が残ります。^{[ 12 ]}

MS法を用いる際の欠点は、ガスクロマトグラフィーの場合、電荷を持つ分子を得るためにサンプルを化学的に誘導体化して前処理する必要があることである。サンプルを誘導体化するために使用される化合物は数多く存在する。N,N-ジメチルホルムアミドジメチルアセタール（DMFDMA）^{[ 14 ]}およびN-（tert-ブチルジメチルシリル）-N-メチルトリフルオロアセトアミド（MTBSTFA）^{[ 15 ]}は、アミノ酸の誘導体化に使用された化合物の2つの例である。

さらに、強い同位体効果が観察され、異なる標識の同位体異性体のGCカラム内での保持時間に影響を与える。GCカラムの過負荷も防がなければならない。^{[ 15 ]}

最後に、炭素以外の原子の自然存在比も質量同位体スペクトルの乱れを引き起こします。たとえば、分子内の各酸素原子は、17O同位体と18O同位体としても存在する可能性があります。^同位体^の自然存在比によるより重要な影響は、29Siと30Siの自然存在比を持つケイ素の影響です。Si^はMS^技術の誘導体化剤として使用されます。^{[ 12 ]}

安定同位体トレーサーを用いたヒトのミネラル栄養と代謝の研究は、1960年代に初めて報告された。^{[ 17 ]}放射性同位体はそれ以前から数十年にわたりヒトの栄養研究に用いられてきたが、安定同位体は、特に放射線被ばくに対する懸念が高まっている対象者（例えば妊婦や授乳中の女性、子供）にとって、より安全な選択肢であった。安定同位体によるその他の利点としては、適切な放射性同位体を持たない元素の研究や、トレーサーの長期的な挙動の研究が可能になることが挙げられる。^{[ 18 ] [ 19 ]}このように、同位体濃縮物質や無機質量分析計の入手可能性が高まるにつれて、安定同位体の使用は一般的になった。安定同位体の使用には、放射性同位体の代わりに、いくつかの欠点がある。すなわち、より多くのトレーサーが必要となり、自然に存在するミネラルを撹乱する可能性がある。分析用試料の調製がより複雑になり、質量分析計の機器がより高価になる。全身または特定の組織におけるトレーサーの存在を外部から測定することはできない。^{[ 20 ]}それにもかかわらず、安定同位体はヒト研究の標準となり、その利点が勝っている。

人間の健康に不可欠で、栄養研究者が特に関心を寄せているミネラルのほとんどは安定同位体を持っており、その一部は天然存在量が少ないため生物学的トレーサーとして適している。^{[ 18 ] [ 20 ]}鉄、亜鉛、カルシウム、銅、マグネシウム、セレン、モリブデンは、安定同位体を持つ必須ミネラルであり、同位体トレーサー法が適用されている。特に鉄、亜鉛、カルシウムは広範囲にわたって研究されている。

研究されるミネラル栄養/代謝の側面には、吸収（消化管から体内へ）、分布、貯蔵、排泄、およびこれらのプロセスの速度論が含まれます。同位体トレーサーは、被験者に経口（食事の有無にかかわらず、またはミネラルサプリメントとともに）および/または静脈内投与されます。その後、血漿、赤血球、尿および/または糞便中の同位体濃縮が測定されます。^{[ 21 ] [ 22 ]}濃縮は母乳^{[ 23 ]}および腸内容物でも測定されています。トレーサー実験の設計は、ミネラルの代謝の違いにより、ミネラルごとに異なる場合があります。たとえば、鉄の吸収は通常、トレーサーの赤血球への取り込みから決定されますが、亜鉛またはカルシウムの吸収は、血漿、尿または糞便中のトレーサーの出現から測定されます。^{[ 24 ] [ 25 ]} 1つの研究で複数の同位体トレーサーを投与することは一般的であり、より信頼性の高い測定方法の使用と代謝の複数の側面の同時調査を可能にします。

食事からのミネラル吸収の測定（しばしば生物学的利用能として捉えられる）は、栄養研究における同位体トレーサー法の最も一般的な応用例である。このような研究の目的には、吸収が食品の種類（例：植物性食品か動物性食品か、母乳か粉ミルクか）、食事の他の成分（例：フィチン酸）、疾患や代謝障害（例：環境性腸機能障害）、生殖周期、食事中のミネラルの量、慢性的なミネラル欠乏、被験者の年齢、恒常性メカニズムによってどのように影響を受けるかの調査が含まれる。このような研究の結果がミネラルについて得られると、そのミネラルの人間の生理的および食事的必要量の推定の基礎として役立つ可能性がある。^{[ 26 ] [ 27 ]}

ミネラルの吸収と代謝を観察する目的でトレーサーを食品とともに投与する場合、それは内在性標識または外在性標識の形をとることがあります。^{[ 28 ] [ 29 ]}内在性標識は、食品の製造中に食品に導入された同位体であり、食品の天然ミネラル含有量を濃縮します。一方、外在性標識は、研究中に食品にトレーサー同位体を加えることを指します。内在性標識は非常に時間と費用がかかる方法であるため、日常的に使用されることはありません。さまざまな食品の内在性標識と外在性標識を使用した吸収の測定を比較した研究では、一般的に2つの標識方法の間で良好な一致が示されており、外在性ミネラルと天然ミネラルは人間の消化管で同様に処理されるという仮説を支持しています。

濃縮度は、質量分析法によるトレーサー同位体と参照同位体の比である同位体比の測定から定量化されます。濃縮度の定義と計算方法は、研究者によって複数採用されています。[ 30 ^]複数のトレーサーを同時に使用すると、濃縮度の計算はより複雑になります。濃縮同位体製剤は決して同位体的に純粋ではなく、つまり、すべての元素の同位体が不自然な存在比で含まれているため、複数の同位体トレーサーの濃縮度の計算では、他のトレーサーの存在による各同位体比の摂動を考慮する必要があります。^{[ 30 ]}

資源の乏しい国々ではミネラル欠乏症が蔓延しており、それが人間の健康と幸福に重大な影響を与えているため、国際原子力機関は最近、安定同位体法の詳細かつ包括的な説明を発表し、この知識を欧米の学術センター以外の研究者にも普及させることを促進しました。^{[ 24 ] [ 31 ]}

プロテオミクスでは、ゲノムによって発現される全タンパク質セットの研究において、疾患バイオマーカーの同定には、細胞培養におけるアミノ酸による安定同位体標識（SILAC）の使用が含まれることがあり、これはタンパク質レベルを推定するために使用される同位体標識アミノ酸を提供します。^{[ 32 ]}タンパク質組換えでは、操作されたタンパク質が大量に生産され、同位体標識は関連タンパク質をテストするためのツールです。この方法は、核を13Cまたは15Nで選択的に濃縮するか、核から1Hを枯渇させることに使用されます^{。組換え体は、窒素源として15N-塩化アンモニウムを含む培地でE.coliで発現されます。[33] 得られた15N標識}タンパク質^は、^固定化^金属アフィニティーによって精製さ^れ、その割合が推定されます。標識タンパク質の収量を増やし、同位体標識培地のコストを削減するために、代替手順では、まず非標識培地を使用して細胞量を増やし、それを最小限の標識培地に導入します。^{[ 34 ]}同位体標識のもう1つの応用例は、DNA合成、つまり試験管内での細胞増殖の測定である。H3-チミジン標識を使用して_、細胞内の合成パターン（または配列）を比較する。^{[ 35 ]}

同位体トレーサーは、自然システム、特に陸上および水生環境におけるプロセスを調べるために使用されています。土壌科学では、窒素循環の研究に^{15 N トレーサーが広く使用されていますが、炭素の安定同位体である13} C と放射性同位体である^{14 C は、有機化合物のターンオーバーと}独立栄養生物によるCO ₂の固定の研究に使用されています。たとえば、Marsh ら (2005) は、二重標識 ( ¹⁵ N- および¹⁴ C)尿素を使用して、アンモニア酸化菌によるこの化合物の利用が、エネルギー源 (アンモニア酸化) と炭素源 (化学合成独立栄養炭素固定) の両方として行われることを実証しました。^{[ 36 ]重水素化水は、樹木[ 37 ]または生態系[ 38 ]}における水の運命と年代を追跡するためにも使用されます。

トレーサーは、海洋学において様々なプロセスを研究するために広く用いられています。使用される同位体は通常、自然界に存在するもので、その発生源や生成・崩壊速度が確立されています。しかし、人為起源の同位体も非常に有効に利用できます。研究者たちは、異なる場所や時間における同位体比を測定することで、海洋の物理的プロセスに関する情報を推測します。