水素－重水素交換

水素原子核と重水素原子核は磁気特性が大きく異なるため、 NMR分光法によって区別することが可能です。重水素は^¹H NMRスペクトルでは観測されず、逆にプロトンは^²H NMRスペクトルでは観測されません。高度に重水素化された試料の^¹H NMRスペクトルで小さな信号が観測される場合、これらは残留信号と呼ばれます。これらは分子の重水素化レベルを計算するために使用できます。¹H分析に比べてこの手法の感度が低いため、²H NMRスペクトル^では同様の信号は観測されません。重水素は通常、対応するプロトンと非常によく似た化学シフトを示します。¹³C NMR分光法による分析^{も可能です。水素（ 1/2 ）と}_重水素（1）のスピン値が異なるため、^分裂多重度が異なります。NMR分光法は、分子の部位特異的な重水素化を決定するために使用できます。

別の方法としてHSQCスペクトルを用いる方法がある。通常、HSQCスペクトルは、水素が重水素と交換される一連の時点で記録される。HSQC実験は水素に特異的であるため、水素が交換されるにつれて信号は指数関数的に減衰する。その後、データに指数関数をフィッティングして交換定数を得ることができる。この方法は、タンパク質中のすべての残基について残基特異的な情報を同時に提供する^{[ 7 ] [ 8 ]。}主な欠点は、対象となるタンパク質のスペクトルを事前に割り当てておく必要があることである。これは非常に手間がかかる場合があり、通常、この方法は1分子以下のタンパク質に限定される。25 kDa。HSQC スペクトルを記録するには数分から数時間かかるため、交換速度の速いアミドは他のパルスシーケンスを使用して測定する必要があります。

質量分析法（HDX-MS）で測定される水素/重水素交換の実験ワークフローの図。黒い波線はタンパク質の骨格を表します。青い文字「H」は骨格アミドに結合した水素原子を、赤い文字「D」は骨格アミドに結合した重水素を表します。上から、水素で飽和したタンパク質溶液を濃縮重水素水で希釈すると、骨格アミド中の水素が溶液中の重水素と交換されます。一定の時間点（t ₁ -t ₄）で、酸性化と冷却によって交換反応を停止します。その後、得られたタンパク質サンプルを消化および脱塩するか、場合によっては気相フラグメンテーションにかけます。タンパク質が消化された場合、得られたペプチドは液体クロマトグラフィー（LC）と質量分析法（MS）を組み合わせて分離されます。非重水素化コントロール（t ₀）を含む各時間点について、各ペプチドの平均質量が測定されます。次に、一般的ではないものの、各分析対象物をフラグメンテーション処理することで、含まれる水素と重水素の位置を特定することも可能です。解釈を容易にするため、ここではMS/MSスペクトルにc型イオンのみを示していますが、他の種類のフラグメントイオンも観察できます。

水素-重水素交換質量分析法（HX-MSまたはHDX-MS）は、H/D交換を受けた分子の全体的な重水素含有量を決定できます。必要なサンプル調製のため、通常は交換不可能な水素原子のみを正確に測定するものと考えられています。また、イオン化前に気相でのH/D交換^{[ 9 ]または溶液相での交換[ 3 ]}を行うこともできます。タンパク質のHDX-MSは、NMR分光法でモニターされるHDXと比較して、いくつかの利点があります。必要なサンプル材料がはるかに少なく、サンプルの濃度が非常に低く（0.1 μM程度）、サイズ制限がはるかに大きく、データの収集と解釈が通常はるかに迅速に行えます。^{[ 10 ]}

重水素原子核は、陽子だけでなく中性子も含むため、水素原子核の2倍の重さになります。したがって、重水素を含む分子は、すべて水素を含む分子よりも重くなります。タンパク質の重水素化が進むにつれて、分子量もそれに応じて増加します。タンパク質の重水素化に伴う質量の変化を検出することは、1991年にKattaとChaitによって初めて報告された現代のタンパク質質量分析法によって可能になりました。^{[ 11 ]}

質量分析法による部位特異的重水素化の決定は、NMR分光法を用いるよりも複雑です。例えば、ペプチド骨格に沿った重水素交換の位置と相対量は、交換反応が停止した後にタンパク質をプロテオリシスにかけることでおおよそ決定できます。次に、個々のペプチドを分析して、各ペプチド断片の全体的な重水素化を調べます。この手法では、重水素交換の分解能は、消化中に生成されるペプチドのサイズによって決まります。^{[ 12 ]} 酸性プロテアーゼであるペプシンは、プロテオリシス反応中に停止pHを維持する必要があるため、プロテオリシスによく使用されます。逆交換を最小限に抑えるため、プロテオリシスとそれに続く質量分析はできるだけ迅速に行う必要があります。逆交換を最小限に抑えるため、ペプシン消化物のHPLC分離は、エレクトロスプレー質量分析の直前に低温で行われることがよくあります。最近では、分離能力に優れているため、UPLCが使用されています。 ^{[ 13 ]}

1999年に、タンデム質量分析法と併用して重水素化ペプチドの衝突誘起解離（CID）フラグメンテーションを使用することで、単一残基分解能を達成できる可能性があると提案されました。すぐに、CIDはペプチド内の重水素の位置を「スクランブル」することが発見されました。^{[ 14 ] [ 15 ]}しかし、MALDIインソース分解（ISD）、電子捕獲解離（ECD）、および電子移動解離（ETD）によって生成されるフラグメンテーションは、適切な実験条件下ではほとんどまたは全くスクランブルせずに進行します。^{[ 16 ] [ 17 ] [ 18 ]}同位体標識のスクランブルは、イオンの解離前の衝突加熱によって引き起こされ、CIDはスクランブルを引き起こしますが、衝突加熱はイオン化およびイオン輸送中にも発生する可能性があります。^{[ 19 ]}しかし、イオン加熱を引き起こす装置パラメータを慎重に最適化することで、水素スクランブリングを最小限に抑え、スクランブリングが発生しない手法を用いてフラグメンテーションを実行できるまで、溶液相の同位体標識を保持することができる。^{[ 17 ] [ 18 ] [ 20 ] [ 21 ]}最近では、ペプチドやタンパク質内の重水素を局在化するためのフラグメンテーション手法として、紫外線光解離（UVPD）も研究されている。^{[ 22 ] [ 23 ]}この点に関して、結論はまちまちで、特定の条件下ではスクランブリングを受けていないUVPDフラグメントを得ることは可能であるが、UVPDフラグメンテーションステップ自体でペプチドとタンパク質の両方でスクランブリングが発生する可能性があることを示したものもある。^{[ 22 ] [ 23 ]}これらの明らかな矛盾を統合する理論は、ペプチドやタンパク質のUV照射から生じる可能性のある二重フラグメンテーション経路、すなわち直接解離と統計的解離に関係している。^{[ 24 ]}つまり、実験条件が直接解離を促進し、前駆イオンが断片化の前と最中に低い内部エネルギーに保たれている場合、結果として生じる断片の重水素レベルは、スクランブルされていない前駆イオンに対応する。^{[ 22 ]}しかし、実験条件によっては、特に長時間の照射と低ガス圧の場合、UV照射中に統計的解離が促進され、UV光子によってもたらされる電子励起エネルギーの内部変換が起こる可能性がある。^{[ 23 ]}その結果、照射された分子の振動励起が起こり、それがスクランブリングを起こす。

多成分系における1つの成分を完全に重水素化することで、中性子散乱実験において、重水素化溶媒を用いた場合よりも十分なコントラストを得ることができる。

中性子結晶学以外では、H/D交換によるタンパク質の構造を決定することは不可能であり、二次構造要素を定義することも不可能である。その理由は、タンパク質の構造が交換速度を遅くする仕組みに関係している。交換速度は、溶媒接近性と水素結合という2つのパラメータの関数である。したがって、分子内水素結合の一部であるアミドは、交換が遅くなるか、あるいは全く交換されないのに対し、タンパク質表面で水と水素結合しているアミドは急速に交換される。溶媒から埋もれているが水素結合していないアミドも、非常に遅い交換速度を示す可能性がある。溶媒接近性と水素結合の両方が交換速度に寄与するため、結晶学やNMR構造データなしに、特定の交換速度を構造要素に帰属させることは困難になる。

H-D交換は、交換条件下でタンパク質を再折り畳むことにより、タンパク質の折り畳み経路を特徴づけるために用いられてきた。順方向交換実験（HからD）では、様々な折り畳み時間後に重水素パルスが添加される。急速に形成される構造部分は保護され交換されない一方、経路の後半で折り畳まれる領域はより長い時間交換にさらされる。したがって、H/D交換は様々な折り畳みイベントの順序を決定するために使用できる。この手法の時間分解能を決定する要因は、混合効率と標識後にクエンチをどれだけ迅速に行えるかである。

^{H–D交換は、タンパク質構造[ 25 ]}およびタンパク質間相互作用^{[ 26 ]}の特性評価に用いられてきた。交換反応は、単離されたタンパク質と複合体の両方で実施する必要がある。交換領域はその後比較される。結合によって領域が埋もれている場合、その領域のアミドは複合体内で保護され、交換速度が遅くなる可能性がある。しかし、H–D交換はすべてのタンパク質間相互作用の結合界面を特定するために使用できるわけではないことに留意する必要がある。一部のタンパク質間相互作用は側鎖の静電力によって駆動され、特にアミド水素がαヘリックスなどの安定な構造要素に位置している場合は、主鎖アミド水素の交換速度を変化させる可能性は低い。

最後に、H-D交換は、タンパク質の機能に関連するタンパク質の立体構造変化をモニタリングするために使用できます。翻訳後修飾、酵素活性化、薬剤結合、またはその他の機能イベントの結果として立体構造が変化すると、検出可能なH/D交換の変化が生じる可能性があります。^{[ 27 ]}

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