等圧標識

同重体標識は、定量的プロテオミクスで使用される質量分析戦略です。ペプチドまたはタンパク質は、名目上は同一の質量（同重体）を持つ化学基で標識されますが、その構造における重同位体の分布は異なります。一般にタンデム質量タグと呼ばれるこれらのタグは、タンデム質量分析中に高エネルギー衝突誘起解離（HCD）によって特定のリンカー領域で質量タグが切断され、異なる質量のレポーターイオンが生成されるよう設​​計されています。

最も一般的な同重体タグはアミン反応性タグです。^[1]ただし、システイン残基やカルボニル基と反応するタグも報告されています。^[2]これらのアミン反応性基は、3 種類の官能基に基づくN-ヒドロキシスクシンイミド (NHS)反応を経ます。 ^[2]同重体標識法には、タンデム質量タグ (TMT)、相対および絶対定量用同重体タグ (iTRAQ)、絶対および相対定量用質量差分タグ、およびジメチル標識があります。^[1] TMT 法と iTRAQ 法は、これらの方法の中で最も一般的で開発されています。^[1]タンデム質量タグには、質量レポーター領域、切断可能なリンカー領域、質量正規化領域、およびタンパク質反応性基があり、総質量は同じです。^[3]

典型的なボトムアッププロテオミクスワークフローは、(Yates、2014) で説明されています。^{[2]タンパク質サンプルは}プロテアーゼによって酵素分解され、ペプチドが生成されます。分解された各実験サンプルは、タグの異なる同位体バリアントのセットから派生したものです。サンプルは通常、等比で混合され、1 回の MS 実行で同時に分析されます。タグは同重体で化学的特性が同じであるため、タグの同位体バリアントは、同じ液体クロマトグラフィー (LC) 保持時間で MS1 スキャンの同じ m/z 値に単一の複合ピークとして表示されます。MS2 分析中およびフラグメンテーション時に、タグの各同位体バリアントは、配列固有のプロダクトイオンを生成します。これらのプロダクトイオンは、ペプチド配列と、組み合わせたサンプル内のペプチドの相対比率を反映する存在量を示すレポータータグを決定するために使用されます。タグを検出するには MS/MS を使用する必要があるため、ラベルのないペプチドは定量化されません。

以前に（Lee、Choe、Aggarwal、2017）によって説明されています。^[4]他の定量技術（ラベルフリーなど）に対する同重体ラベリングの主な利点は、マルチプレックス機能と、それによるスループットの向上です。1回のLC-MS実行で複数のサンプルを同時に組み合わせて分析できるため、複数のデータセットを分析する必要がなくなり、実行間の変動がなくなります。マルチプレックス化により、サンプル処理の変動が低減し、各条件からのペプチドを同時に定量することで特異性が向上し、複数のサンプルのターンアラウンドタイムが短縮されます。マルチプレックス化を行わないと、実行ごとに情報が失われる可能性があり、識別と定量に影響します。これは、1回のLC-MS/MS実行で断片化用に選択されたペプチドが、後続のサンプル実行では存在しないか、適切な量にならない可能性があるためです。現在利用可能な同重体化学タグを使用すると、2〜11個の実験サンプルを同時に分析できます。

同重体標識は、タンパク質の同定と定量、正常状態と異常状態のタンパク質発現プロファイリング、抗体が利用できないタンパク質の定量分析、翻訳後修飾タンパク質の同定と定量など、多くの生物学的アプリケーションに効果的に使用されています。^[4]

市販されているアイソバリックタグには、タンデム質量タグ（TMT）と相対・絶対定量用アイソバリックタグ（iTRAQ）の2種類があります。アミン反応性TMTは、デュプレックス、6プレックス、10プレックス、そして現在は11プレックスのセットで利用可能です。^[5]アミン反応性iTRAQは、4プレックスと8プレックスの形で利用可能です^[6]。