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ハイブリドーマ技術は、抗体産生B細胞と骨髄腫細胞（がん化したB細胞）を融合させることで、モノクローナル抗体を大量生産する方法です。この技術によって、親B細胞由来の抗体を産生しつつ、親骨髄腫細胞株の持つ不死性（無限に増殖する性質）や細胞培養に適した特性を維持するハイブリッド細胞、ハイブリドーマが作製されます。使用されるB細胞は、一般的に、抗体を標的とする 抗原で免疫された動物から採取されます。
ハイブリドーマを形成した後、スクリーニングとモノクローナル化の前に、非ハイブリッド細胞はすべて死滅させ、単一の親細胞に由来するハイブリドーマ株を作成し、それによって目的の標的に対して同じ抗体を産生させる。
モノクローナル抗体の生産は、 1975年にセザール・ミルスタインとジョルジュ・J・F・ケーラーによって発明されました。彼らは、免疫学に他の貢献をしたニールス・カイ・イェルネとともに、1984年のノーベル生理学・医学賞を受賞しました。ハイブリドーマという用語は、1976年から1977年にかけてミルスタインの研究室でサバティカル休暇を過ごしていたレオナルド・ヘルツェンベルクによって造られました。 [ 1 ]
実験動物（哺乳類、例えばマウス）は、まず抗体産生の対象となる抗原に曝露されます。通常、これは数週間にわたって問題の抗原を複数回注射することによって行われます。これらの注射の後には、免疫応答を大幅に増強する生体内電気穿孔法が用いられるのが一般的です。哺乳類の脾臓から脾細胞が分離されたら、B細胞は不死化骨髄腫細胞と融合されます。B細胞と骨髄腫細胞の融合は、電気融合法を用いて行うことができます。電気融合法では、電場を印加することでB細胞と骨髄腫細胞が整列して融合します。あるいは、B細胞と骨髄腫細胞は、ポリエチレングリコールを用いた化学的方法によって融合させることもできます。骨髄腫細胞は、抗体を分泌していないこと、およびヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRT）遺伝子を欠損していることを事前に選択し、 HAT培地（下記参照）に対して感受性（または脆弱）であることを確認します。
融合した細胞は、HAT培地（ヒポキサンチン-アミノプテリン-チミジン培地）で約10～14日間培養されます。アミノプテリンはヌクレオチド合成経路を阻害します。そのため、融合していない骨髄腫細胞はHGPRT遺伝子を持たないため、 de novo経路またはサルベージ経路でヌクレオチドを産生できず、死滅します。融合していない骨髄腫細胞は、特に弱く確立されたハイブリドーマなど、他の細胞よりも増殖する可能性があるため、除去する必要があります。融合していないB細胞は寿命が短いため死滅します。このようにして、B細胞由来のHGPRT遺伝子が機能しているため、B細胞-骨髄腫ハイブリッドのみが生存します。これらの細胞は抗体を産生し（B細胞の特性）、不死化します（骨髄腫細胞の特性）。培養した培地は、各ウェルに1つの細胞だけが含まれるようにマルチウェルプレートに希釈されます。同一ウェル内の抗体は同じB細胞によって産生されるため、同じエピトープを標的とし、したがってモノクローナル抗体となる。
次の段階は、適切な特異性を持つ抗体を産生するハイブリドーマのみを同定して選択する迅速な一次スクリーニングプロセスです。最初に使用されるスクリーニング技術はELISAと呼ばれます。ハイブリドーマ培養上清、二次酵素標識コンジュゲート、および発色基質をインキュベートし、着色生成物の形成は陽性ハイブリドーマを示します。あるいは、免疫細胞化学、[ 2 ]ウェスタンブロット、および免疫沈降質量分析法があります。ウェスタンブロットアッセイとは異なり、免疫沈降質量分析法は、抗原タンパク質の天然型（非変性型）に結合するクローンのスクリーニングとランク付けを容易にします。[ 3 ]フローサイトメトリースクリーニングは、細胞表面の抗原の天然型を認識する多数の（約1000）ハイブリドーマクローンの一次スクリーニングに使用されています。[ 4 ]フローサイトメトリーに基づくスクリーニングでは、各ハイブリドーマ上清サンプルに対して、抗原陰性細胞と抗原陽性細胞の混合物が検査対象の抗原として使用されます。[ 4 ]
目的の抗体を産生するB細胞はクローン化して、多数の同一の娘クローンを産生することができる。このステップには、インターロイキン-6 （ブリクロンなど）を含む補助培地が不可欠である。ハイブリドーマコロニーが確立されると、RPMI-1640（抗生物質とウシ胎児血清を含む）などの培養培地で継続的に増殖し、抗体を産生する。[ 2 ]
ハイブリドーマの培養にはまずマルチウェルプレートを使用し、選抜後、より大きな組織培養フラスコに移します。これにより、ハイブリドーマの良好な状態が維持され、凍結保存に十分な細胞と、その後の研究に必要な上清が得られます。培養上清からは1～60μg/mlのモノクローナル抗体が得られ、必要になるまで-20℃以下 で保存されます。 [ 2 ]
培養上清または精製免疫グロブリン製剤を使用することにより、潜在的なモノクローナル抗体産生ハイブリドーマの反応性、特異性、および交差反応性についてさらに分析することができる。[ 2 ]
モノクローナル抗体の用途は多岐にわたり、疾患の予防、診断、治療などが含まれます。例えば、モノクローナル抗体はB細胞とT細胞のサブセットを識別することができ、これは様々な種類の白血病の特定に役立ちます。さらに、特定のモノクローナル抗体は、白血球やその他の細胞種の表面マーカーを定義するために使用されてきました。これにより、分化抗原クラスター（CD）マーカーシリーズが開発されました。これらはしばしばCDマーカーと呼ばれ、数百種類もの異なる細胞表面成分を定義し、それぞれが特定のモノクローナル抗体の結合によって識別されます。このような抗体は、特定の種類の細胞を特異的に分離する蛍光活性化セルソーティングに非常に有用です。
モノクローナル抗体の助けを借りて、組織や臓器は、組織や細胞の発生を反映する特定の定義されたマーカーの発現に基づいて分類することができます。前立腺特異抗原、胎盤アルカリホスファターゼ、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、α-フェトプロテインなどは臓器関連抗原であり、これらの抗原に対するモノクローナル抗体の産生は、原発腫瘍の性質を決定するのに役立ちます。[ 2 ]
モノクローナル抗体は、胸膜中皮腫や腹膜中皮腫、腺癌などの形態学的に類似した病変を区別したり、未分化転移の臓器または組織の起源を特定したりするのに特に有用です。選択されたモノクローナル抗体は、骨髄、他の組織吸引液、リンパ節、その他の組織の免疫細胞学的分析によって潜在性転移（原発不明の癌）を検出するのに役立ち、通常の組織病理学的染色よりも感度が高くなります。[ 2 ]
ある研究[ 5 ]では、限局性前立腺癌患者20人の骨髄穿刺液に対して高感度免疫組織化学アッセイを実施した。このアッセイでは、腫瘍細胞を検出するために上皮細胞が発現する膜抗原および細胞骨格抗原を認識できる3種類のモノクローナル抗体（T16、C26、AE-1）が使用された。限局性前立腺癌患者の22%（ステージB、0/5；ステージC、2/4）および転移性前立腺癌患者の36%（ステージD1、0/7；ステージD2、4/4）の骨髄穿刺液に抗原陽性細胞が認められた。この結果から、骨髄穿刺液の免疫組織化学染色法は、一見限局性前立腺癌の患者における潜在的な骨髄転移を検出するのに非常に有用であると結論付けられた。
腫瘍関連モノクローナル抗体を用いた免疫細胞化学により、骨髄穿刺液や末梢血中の潜在性乳がん細胞の検出能力は向上したが、日常的に使用できるようになるには、この方法のさらなる開発が必要である。 [ 6 ]免疫細胞化学の大きな欠点の1つは、腫瘍特異的モノクローナル抗体ではなく、腫瘍関連モノクローナル抗体のみが使用されるため、正常細胞との交差反応が起こる可能性があることである。[ 7 ]
乳がんの病期を効果的に判定し、自家幹細胞輸注前の浄化療法の有効性を評価するためには、少量の乳がん細胞でも検出することが重要です。免疫組織化学的方法は、簡便で感度が高く、特異性も高いため、この目的に最適です。Franklin ら[ 8 ]は、腫瘍細胞表面糖タンパク質に対する 4 つのモノクローナル抗体 (260F9、520C9、317G5、BrE-3) の組み合わせを使用して、骨髄および末梢血中の乳がん細胞を同定する高感度免疫細胞化学的アッセイを実施しました。その結果から、骨髄および末梢血の免疫細胞化学的染色法は、乳がん細胞を検出および定量化するための高感度かつ簡便な方法であると結論付けました。
固形腫瘍患者における転移再発の主な原因の一つは、悪性細胞の早期播種である。サイトケラチンに特異的なモノクローナル抗体（mAb）を用いることで、骨髄中に播種した個々の上皮性腫瘍細胞を特定することができる。
ある研究[ 9 ]では、サイトケラチン成分18（CK18）と前立腺特異抗原（PSA） を同時に標識する免疫細胞化学的手法を開発したと報告している。これは、前立腺癌患者における個々の上皮性腫瘍細胞のさらなる特徴付けに役立つだろう。良性前立腺肥大症患者からの12の対照吸引液は陰性染色を示し、これは骨髄中の上皮性腫瘍細胞を検出する際のCK18の特異性をさらに裏付けている。
滲出液を伴う悪性疾患のほとんどの症例では、腫瘍細胞は容易に識別できます。しかし、場合によっては、悪性細胞が容易に確認できなかったり、その存在が疑わしいため陽性と断定できないことがあります。このような場合、免疫細胞化学的手法を用いることで診断精度を高めることができます。
Ghosh、Mason、Spriggs [ 10 ] は、悪性疾患の患者 41 名から採取した胸水または腹水 53 検体を分析した。従来の細胞診検査では腫瘍細胞は検出されなかった。3 種類のモノクローナル抗体 (抗 CEA、Ca 1、HMFG-2) を使用して悪性細胞を探索した。免疫細胞化学的標識は、-20 °C で最長 18 か月保存された未染色の塗抹標本に対して行われた。免疫細胞化学的染色を行った 41 例のうち 12 例で悪性細胞が検出された。この結果は、診断精度が約 20% 向上したことを示している。この研究は、悪性疾患が疑われる患者では、細胞診で陰性であった検体の検査に免疫細胞化学的標識をルーチンで使用すべきであり、患者管理に関して重要な意味を持つと結論付けた。
免疫細胞化学染色法のもう1つの応用例は、同じ塗抹標本中の2つの抗原の検出です。軽鎖抗体とT細胞およびB細胞マーカーによる二重染色により、リンパ腫の腫瘍性起源を示すことができます。[ 11 ]
ある研究では、モノクローナル抗体（IgM、κアイソタイプ）を産生するハイブリドーマ細胞株（クローン1E10）の単離が報告されている。このモノクローナル抗体は、核小体の特異的な免疫細胞化学染色を示す。[ 12 ]
組織や腫瘍は、モノクローナル抗体を用いて特定のマーカーの発現に基づいて分類することができます。モノクローナル抗体は、形態学的に類似した病変を区別したり、未分化転移の臓器または組織の起源を特定したりするのに役立ちます。選択されたモノクローナル抗体を用いた骨髄、組織吸引液、リンパ節などの免疫細胞学的分析は、潜在性転移の検出に役立ちます。モノクローナル抗体は、少量の浸潤性細胞や転移性細胞であっても検出感度を高めます。サイトケラチンに特異的なモノクローナル抗体（mAb）は、骨髄中の個々の上皮性腫瘍細胞を検出できます。