Loading article…
遺伝子導入とは、 DNAやRNAなどの外来遺伝物質を宿主細胞に導入するプロセスである。[ 1 ]遺伝子導入は、遺伝子発現を誘導するために宿主細胞のゲノムに到達しなければならない。[ 2 ]遺伝子導入を成功させるには、外来遺伝子が宿主細胞内で安定に存在し、ゲノムに組み込まれるか、ゲノムとは独立して複製される必要がある。[ 3 ]そのためには、目的の宿主細胞に入り込み、その細胞のゲノムに導入遺伝子を届けるように設計されたベクターの一部として外来DNAを合成する必要がある。[ 4 ]遺伝子導入の方法として利用されるベクターは、組換えウイルスと合成ベクター（ウイルス性および非ウイルス性）の2つのカテゴリーに分類できる。[ 2 ] [ 5 ]
複雑な多細胞真核生物（より具体的にはヴァイスマン型真核生物）では、トランスジーンが宿主の生殖細胞に組み込まれると、結果として生じた宿主細胞はトランスジーンを子孫に伝えることができる。トランスジーンが体細胞に組み込まれると、トランスジーンは体細胞系列、ひいてはその宿主生物に留まる。[ 6 ]
遺伝子導入は、患者の治療効果を高めるために遺伝子を導入または抑制する遺伝子治療において必要なステップであり、作物の遺伝子改変にも応用されています。さまざまな種類の細胞や組織に対して、多くの異なる遺伝子導入方法があります。[ 6 ]
ウイルスベクターは、1980年代に遺伝子導入のためのツールとして登場しました。1983年、アルバート・シーゲルは、cDNAクローニングによるウイルス操作はまだ利用できなかったものの、植物の遺伝子導入におけるウイルスベクターの使用について説明しました。[ 7 ]ワクチンベクターとして使用された最初のウイルスは、 1984年にチンパンジーをB型肝炎から守る方法として使用されたワクシニアウイルスでした。[ 8 ]非ウイルス性遺伝子導入は、外来DNAへの曝露 による細胞表現型の変化を示したエイブリーらによって1943年に初めて報告されました。[ 9 ]
遺伝子を宿主細胞に導入する方法は様々である。細菌や植物に遺伝子を導入する過程は形質転換と呼ばれ、動物に遺伝子を導入する過程はトランスフェクションと呼ばれる。これは、動物における形質転換の意味が異なり、癌化への進行を意味するためである。[ 10 ]一部の細菌は、外来DNAを自然に取り込むことができるため、遺伝子を導入するための外部的な方法は必要ない。[ 11 ]ほとんどの細胞は、細胞膜をDNAに対して透過性にして、DNAを宿主ゲノムに安定的に挿入できるようにするために、何らかの介入を必要とする。
化学に基づいた遺伝子導入法では、天然または合成化合物を使用して、細胞への遺伝子導入を促進する粒子を形成することができる。[ 2 ]これらの合成ベクターは、DNAまたはRNAを静電的に結合し、遺伝情報を圧縮してより大きな遺伝子導入に対応できる能力を持つ。[ 5 ]化学ベクターは通常、エンドサイトーシスによって細胞内に入り、遺伝物質を分解から保護することができる。[ 6 ]
最も単純な方法の一つは、細胞の環境を変化させ、熱ショックを与えることで細胞にストレスを与えるというものです。通常、細胞は二価陽イオン（多くの場合、塩化カルシウム）を含む溶液中で低温条件下で培養された後、熱パルスにさらされます。塩化カルシウムは細胞膜を部分的に破壊し、組換えDNAが宿主細胞内に入ることを可能にします。低温条件下で細胞を二価陽イオンにさらすことで、細胞表面構造が変化または弱まり、DNAの透過性が高まることが示唆されています。熱パルスは細胞膜を挟んで熱的不均衡を引き起こし、DNAが細胞孔または損傷した細胞壁を通って細胞内に入るように強制すると考えられています。
別の簡単な方法としては、リン酸カルシウムを用いて DNAを結合させ、それを培養細胞に曝露させる方法がある。溶液はDNAとともに細胞に包み込まれ、少量のDNAがゲノムに組み込まれる。[ 12 ]
リポソームとポリマーは、DNAを細胞に送達するためのベクターとして使用できます。正に帯電したリポソームは負に帯電したDNAと結合し、一方、ポリマーはDNAと相互作用するように設計できます。[ 2 ]これらはそれぞれリポプレックスとポリプレックスを形成し、その後細胞に取り込まれます。[ 13 ] 2つのシステムを組み合わせることもできます。[ 6 ]ポリマーベースの非ウイルスベクターは、ポリマーを使用してDNAと相互作用し、ポリプレックスを形成します。[ 6 ]
人工的に作製された無機および有機ナノ粒子の使用は、遺伝子送達のためのもう一つの非ウイルス的アプローチである。[ 14 ] [ 15 ]
人工遺伝子導入は、細胞膜を通して遺伝物質を導入するために力を用いる物理的方法によって媒介される。[ 2 ]
エレクトロポレーションは、コンピテンスを促進する方法の一つである。細胞に10～ 20kV /cmの電場を短時間照射することで、細胞膜に穴が開き、そこからプラスミドDNAが細胞内に入り込むと考えられている。電気ショック後、これらの穴は細胞の膜修復機構によって速やかに閉じられる。
植物細胞を形質転換する別の方法として、バイオリスティクスがあります。これは、金またはタングステンの粒子をDNAでコーティングし、若い植物細胞または植物胚に注入する方法です。[ 16 ]一部の遺伝物質が細胞に入り込み、細胞を形質転換します。この方法は、アグロバクテリウム感染に感受性のない植物にも使用でき、植物のプラスチドの形質転換も可能です。植物細胞は、電気ショックを使用して細胞膜をプラスミドDNAに対して透過性にするエレクトロポレーションによっても形質転換できます。細胞とDNAに損傷を与えるため、バイオリスティクスとエレクトロポレーションの形質転換効率は、アグロバクテリウムによる形質転換よりも低くなります。[ 17 ]
マイクロインジェクションとは、DNAを細胞の核膜を通して核内に直接注入する方法である。[ 11 ]
ソノポレーションは、通常、ガスマイクロバブルの存在下で超音波によって促進される細胞膜の一時的な透過である。[ 18 ]ソノポレーションにより、遺伝物質が細胞内に侵入する。[ 19 ] [ 20 ]
光穿孔法とは、レーザー光を照射して細胞膜に小さな孔を作り、遺伝物質を細胞内に導入する技術である。
マグネトフェクションは、DNAと複合体を形成した磁性粒子と外部磁場を用いて、核酸粒子を標的細胞に集中させる手法である。
流体力学的毛細管現象を利用して、細胞透過性を操作することができる。
植物では、DNAはアグロバクテリウム媒介組換えを利用して挿入されることが多い[ 21 ]。これは、植物細胞への遺伝物質の自然な挿入を可能にするアグロバクテリウムのT-DNA配列を利用するものである[22]。植物組織を細かく切断し、懸濁したアグロバクテリウムを含む液体に浸す。細菌は切断によって露出した多くの植物細胞に付着する。細菌は接合を利用して、プラスミドからT-DNAと呼ばれるDNA断片を植物に転送する。転送されたDNAは植物細胞の核に誘導され、宿主植物のゲノムDNAに組み込まれる。プラスミドT-DNAは宿主細胞のゲノムに半ランダムに組み込まれる[ 23 ] 。
プラスミドを改変して目的の遺伝子を発現させることで、研究者は選択した遺伝子を植物のゲノムに安定的に挿入することができる。T-DNAの必須部分は、2つの小さな（25塩基対）境界反復配列のみであり、そのうち少なくとも1つが植物形質転換に必要である。[ 24 ] [ 25 ]植物に導入する遺伝子は、プラスミドのT-DNA領域を含む植物形質転換ベクターにクローニングされる。別の方法として、アグロインフィルトレーションがある。[ 26 ] [ 27 ]
ウイルスを介した遺伝子導入は、ウイルスが宿主細胞内にDNAを注入する能力を利用し、ウイルス自身の複製能力と遺伝物質を実行する能力を活用します。ウイルスによる遺伝子導入法は免疫応答を誘発する可能性が高いですが、効率は高いです。[ 6 ]形質導入とは、ウイルスを介してDNAを宿主細胞に挿入するプロセスを指します。ウイルスは、ウイルスの構造が宿主細胞の核に送達されるDNAのリソソームによる分解を防ぐため、特に効果的な遺伝子導入法です。 [ 28 ]遺伝子治療では、送達を目的とする遺伝子が複製欠損ウイルス粒子にパッケージ化され、ウイルスベクターが形成されます。[ 29 ]これまでに遺伝子治療に使用されたウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルスなどがあります。しかし、ウイルスを使用して細胞に遺伝子を導入することには欠点があります。ウイルスはごく小さなDNA断片しか細胞内に送り込むことができず、手間がかかり、ランダムな挿入部位、細胞変性効果、突然変異のリスクがある。[ 30 ]
ウイルスベクターを用いた遺伝子導入法は、ウイルスベクターを用いて遺伝物質を宿主細胞に導入する。これは、目的の遺伝子を含むウイルスを用い、ウイルスのゲノムのうち感染性のある部分を取り除くことによって行われる。[ 2 ]ウイルスは、複製に不可欠な宿主細胞の核に遺伝物質を効率的に導入することができる。[ 2 ]
RNAベースのウイルスは、感染性RNA転写産物から直接転写できる能力があるため開発されました。RNAベクターは迅速に発現し、処理を必要としないため、標的の形で発現します[出典が必要]。レトロウイルスベクターには、オンコレトロウイルス、レンチウイルス、ヒトフォーミーウイルスなどがあり、これらは逆転写して宿主ゲノムに組み込まれ、長期のトランスジーン発現を可能にするRNAベースのウイルスベクターです。[ 2 ]
DNAベースのウイルスベクターには、アデノウイルス科、アデノ随伴ウイルス、単純ヘルペスウイルスなどがある。[ 2 ]
遺伝子導入を促進するために使用されるいくつかの方法は、治療目的で応用されています。遺伝子治療は、細胞内の疾患や状態を治療することを目的として、遺伝子導入を利用して遺伝物質を細胞内に送達します。治療環境における遺伝子導入は、細胞特異性を持つ非免疫原性ベクターを使用し、目的の効果を引き起こすのに十分な量のトランスジーン発現を送達することができます。[ 3 ]
ゲノミクスの進歩により、さまざまな新しい方法と遺伝子ターゲットが特定され、応用の可能性が広がってきました。さまざまな次世代シーケンシングで使用されるDNAマイクロアレイは、数千の遺伝子を同時に特定することができ、解析ソフトウェアは遺伝子発現パターンを調べ、モデル生物の相同遺伝子を調べて機能を特定します。[ 31 ]これにより、遺伝子治療に使用できるさまざまなベクターが特定されました。新しいクラスのワクチンを作成する方法として、遺伝子送達が、ワクチンを送達するためのハイブリッド生合成ベクターを生成するために利用されています。このベクターは、大腸菌と合成ポリマーを組み合わせることで、標的細胞のリソソームによる分解を回避する能力を高めながらプラスミドDNAを維持するベクターを作成することにより、従来の遺伝子送達の障壁を克服しています。[ 32 ]
{{cite book}}: CS1メンテナンス: 場所 (リンク)