生物学的小角散乱

生物学的小角散乱は、生物学的材料の構造解析のための小角散乱法である。小角散乱は、生物学的高分子、ナノ複合材料、合金、合成ポリマーの溶液など、さまざまな物体の構造を研究するために使用される。^[1]小角X線散乱（SAXS）と小角中性子散乱（SANS）は、小角散乱（SAS）として総称される2つの補完的な技術である。^{[2] SASは、} X線および中性子回折、広角X線散乱、および静的光散乱に類似した方法である。他のX線および中性子散乱法とは対照的に、SASは結晶性粒子と非結晶性粒子の両方のサイズと形状に関する情報をもたらす。水溶液中に存在することが多い生物学的材料の研究に使用する場合、散乱パターンは配向平均化される。^{[3] [4]}

SAS パターンは、数度の小さな角度で収集されます。SAS は、1 ～ 25 nmの解像度範囲で構造情報を提供でき、最大 150 nm のサイズの部分的に整列したシステムの繰り返し距離を提供できます。超小角散乱 (USAS) は、さらに大きな次元を解像できます。斜入射小角散乱(GISAS) は、表面上の生物学的分子層を研究するための強力な手法です。

生物学の分野では、SAS は粒子の平均サイズと形状の観点から粒子の構造を決定するために使用されます。また、表面積と体積の比率に関する情報も得られます。通常、生物学的高分子は液体に分散されています。この方法は正確で、ほとんどが非破壊的であり、通常は最小限のサンプル準備のみが必要です。ただし、生物学的分子は常に放射線による損傷を受けやすいです。

溶液NMRやX線結晶構造解析などの他の構造決定法と比較して、SASではいくつかの制約を克服することができます。たとえば、溶液NMRはタンパク質のサイズに制限されますが、SASは小さな分子だけでなく大きな多分子アセンブリにも使用できます。固体NMRは、40 kDaを超える高分子やアミロイド線維などの非結晶サンプルの原子レベルの情報を決定するために今でも不可欠なツールです。X線結晶構造解析による構造決定には数週間から数年かかる場合がありますが、SAS測定は数日で完了します。SASは、サイズ排除クロマトグラフィーなどの他の分析技術と組み合わせて、不均一なサンプルを研究することもできます。^[5]ただし、SASでは分子内の原子の位置を測定することはできません。

概念的には、小角散乱実験は単純です。サンプルをX 線または中性子にさらし、散乱した放射線を検出器で記録します。SAS 測定は一次ビームの非常に近く (「小角」) で実行されるため、この手法では、高度にコリメートまたはフォーカスされたX 線または中性子ビームが必要です。生物学的小角 X 線散乱は、通常、生物学的分子の散乱が弱く、測定対象溶液が希薄であるため、シンクロトロン放射源で実行されることがよくあります。生物学的 SAXS 法は、シンクロトロン ストレージ リングによって提供される X 線光子ビームの高強度を利用します。X 線または中性子散乱曲線 (強度対散乱角) を使用して、右の図に示すタンパク質の低解像度モデルを作成します。さらに、X 線または中性子散乱データを使用して、個別のドメイン (X 線またはNMR構造) を「SAXS エンベロープ」に適合させることができます。

散乱実験では、高分子溶液をX線（波長 λは通常約0.15 nm）または熱中性子（λ ≈0.5 nm）にさらします。散乱強度I(s) は、運動量移動sの関数として記録されます（s=4πsinθ/λ、ここで2θは入射放射線と散乱放射線の間の角度です）。溶液の強度から、溶媒からの散乱のみを差し引きます。粒子のランダムな位置と方向により、等方性強度分布が生じます。これは、相互作用しない単分散粒子の場合、すべての方向で平均した単一粒子からの散乱に比例します。正味の粒子散乱は、粒子と溶媒間の散乱長密度（X線の場合は電子密度、中性子の場合は核/スピン密度）の差の2乗に比例します。これをコントラストと呼びます。中性子散乱では、H ₂ O/ D ₂ O混合物または選択的重水素化を使用してコントラストを変化させ、追加情報を得ることができます。^[1] SASデータの情報内容は、右の図に示されています。この図は、異なるフォールドと分子量を持つタンパク質のX線散乱パターンを示しています。低角度（2〜3 nmの解像度）では、曲線はsの急速に減衰する関数であり、基本的に粒子の形状によって決まり、明らかに異なります。中程度の解像度（2〜0.5 nm）では、違いはすでにそれほど顕著ではなく、0.5 nmを超える解像度ではすべての曲線が非常に似ています。^[6]したがって、SASには、形状、四次構造、三次構造などの大まかな構造的特徴に関する情報が含まれていますが、原子構造の分析には適していません。

最初の応用は、ギニエが金属合金の研究に続いて基礎研究で SAXS の主要原理を開発した 1930 年代後半に遡ります。ギニエとフルネによる SAXS に関する最初のモノグラフでは、この方法によって粒子のサイズと形状に関する情報だけでなく、無秩序および部分的に秩序のあるシステムの内部構造に関する情報も得られることがすでに実証されていました。

1960 年代には、この方法が溶液中の生体高分子の研究においてますます重要になりました。結晶が存在しない状態で、低解像度で全体の形状と内部構造の構造情報が得られるようになったからです。1970 年代には、シンクロトロン放射と中性子源が利用できるようになり、SAXS と SANS 実験に飛躍的な進歩がもたらされました。中性子源は、H _{2 O から D 2} O への溶媒交換によるコントラストの変化や、特定の重水素化法への道を開きました。溶液の散乱研究により、最小限の時間と労力で、非結晶性の生化学システムの構造に関する有用な洞察が得られることが認識されました。さらに、SAXS/SANS により、高分子アセンブリのアセンブリや大規模な構造変化など、分子間相互作用のリアルタイム調査も可能になりました。

構造解析法としての SAS の主な難しさは、1 次元の実験データから物体の 3 次元構造情報を抽出することです。過去には、高分子の全体的な粒子パラメータ (体積、回転半径など) のみが実験データから直接決定されていましたが、3 次元モデルによる解析は単純な幾何学的物体 (楕円体、円筒など) に限定されていたか、アドホックな試行錯誤で実行されていました。電子顕微鏡は、コンセンサス モデルの構築における制約としてよく使用されていました。1980 年代には、他の構造解析法の進歩により、わずか数個の全体的なパラメータから構造上の結論を導き出したり、試行錯誤のモデルに基づいたりする SAS 研究に対する生化学者の関心が低下しました。

1990年代にはSAXS/SANSデータ解析法に画期的な進歩がもたらされ、形状やドメイン構造の詳細な決定、剛体精密化技術の適用など、高分子複合体の信頼性の高い第一原理モデリングへの道が開かれました。この進歩は計測機器のさらなる進歩を伴い、タンパク質や核酸の折り畳みの研究において、第三世代のSR源でサブミリ秒の時間分解能を達成できるようになりました。^[1]

2005年に4年間のプロジェクトが開始されました。Small- Angle X - Ray scattering I nitiative for Europe (SAXIER)は、S ​​AXS法と他の分析技術を組み合わせ、大量のデータを迅速に分析するための自動化ソフトウェアを作成することを目標としています。このプロジェクトでは、利用可能な最も高度な方法を使用して、統一されたヨーロッパのSAXSインフラストラクチャを作成しました。^[7]

良質の SAS 実験では、調査対象の高分子の濃度が異なる複数の溶液を測定します。さまざまな濃度で測定された散乱曲線をゼロ濃度に外挿することで、無限希釈を表す散乱曲線を得ることができます。そうすれば、濃度の影響は散乱曲線に影響を与えません。外挿された散乱曲線のデータ解析は、s = 0付近の領域での散乱曲線の開始を調べることから始まります。領域がギニエ近似(ギニエの法則とも呼ばれる) に従う場合、サンプルは凝集していません。次に、問題の粒子の形状をさまざまな方法で決定できます。そのうちのいくつかは次の参考文献に記載されています。^[1]

最初のステップは通常、散乱曲線のフーリエ変換を計算することです。変換された曲線は、粒子内の距離分布関数として解釈できます。この変換は、入力データの正規化の利点ももたらします。 ^{[引用が必要]}

SAS データ分析における 1 つの問題は、1 次元の散乱パターンから 3 次元構造を取得することです。SA​​S データは単一のソリューションを意味するものではありません。たとえば、多くの異なるタンパク質が同じ散乱曲線を持つ場合があります。3D 構造を再構築すると、多数の異なるモデルが作成されることがあります。この問題を回避するには、いくつかの単純化を考慮する必要があります。

追加のアプローチは、小角X線と中性子散乱データとモデルをMONSAプログラムと組み合わせることです。

EMBLでは、無料で利用できるSAS解析コンピュータプログラムが集中的に開発されてきました。最初の一般的なab initioアプローチでは、粒子の角度エンベロープ関数r = F(ω)（ここで、（r、ω）は球面座標）が、一連の球面調和関数によって記述されます。したがって、低解像度の形状は、散乱データに適合するいくつかのパラメーター（このシリーズの係数）によって定義されます。このアプローチはさらに開発され、コンピュータプログラムSASHA（Small Angle Scattering Shape Determination）に実装されました。^{[8] [9]}特定の状況下では、散乱データから一意のエンベロープを抽出できることが実証されました。この方法は、比較的単純な形状で、大きな内部空洞のない球状粒子にのみ適用できます。これらの制限を克服するために、異なるタイプのモンテカルロ検索を使用する別のアプローチが開発されました。DALAI_GAは、散乱データから決定された最大粒子サイズDmaxに等しい直径の球を取り、それをビーズで満たすエレガントなプログラムです。各ビーズは粒子（インデックス=1）または溶媒（インデックス=0）のいずれかに属します。したがって、形状は長さMのバイナリ文字列で記述されます。ランダムな文字列から始めて、遺伝的アルゴリズムがデータに適合するモデルを検索します。検索ではコンパクト性と接続性の制約が課され、プログラムDAMMINで実装されています。^{[10] [11]}粒子の対称性がわかっている場合、SASHAとDAMMINはそれを有用な制約として利用できます。相互接続された楕円体に基づく「give-n-take」手順SAXS3DとプログラムSASMODELは、検索空間に制限のない第一原理モンテカルロアプローチです。^[6]

ダミー残基（DR）のアンサンブルとシミュレーテッドアニーリングを使用して、直径Dmaxの球体内に局所的に「チェーン互換」なDRモデルを構築するアプローチにより、 SAXSデータからより多くの詳細を抽出できます。この方法は、プログラムGASBORに実装されています。^{[12] [13]}

マルチドメインタンパク質および高分子複合体の溶液散乱パターンは、三次構造が保存されていると仮定して、個々のドメインまたはサブユニットの高解像度（ NMRまたはX 線）構造から構築されたモデルを使用してフィッティングすることもできます。オブジェクトの複雑さに応じて、実験データに適合するサブユニットの最適な構成を全体的に検索するために、さまざまなアプローチが使用されます。

モンテカルロベースのモデルには数百または数千のパラメータが含まれており、過剰解釈を避けるための注意が必要です。一般的なアプローチは、独立した形状再構成の実行から得られたモデルのセットを整列させて、最も永続的で、おそらく最も信頼性の高い特徴を保持する平均モデルを取得することです（たとえば、プログラムSUPCOMBを使用）。^{[6] [14] [15]}

不規則な表面アミノ酸（「ループ」）は、NMRや結晶構造解析の研究ではしばしば観察されず、報告されたモデルでは欠落したままになることがあります。このような不規則な要素は散乱強度に寄与し、その推定位置は、構造の既知の部分を固定し、欠落部分を追加して粒子全体のSASパターンに適合させることで見つけることができます。ダミー残基アプローチは拡張され、欠落したループまたはドメインを追加するためのアルゴリズムがプログラムスイートCREDOに実装されました。^[6]

最近、SAXS データを制約として使用する方法がいくつか提案されました。著者らは、フォールド認識^[16]とde novo タンパク質構造予測^[17]方法の結果を改善することを目指しました。SAXS データは、特定のタンパク質の原子対距離 (ペア分布関数) のヒストグラムのフーリエ変換を提供します。これは、タンパク質のネイティブなコンフォメーション フォールドを決定するために使用される方法に対する構造制約として機能します。スレッディングまたはフォールド認識では、3D 構造が配列よりも保存されていると想定されています。したがって、非常に異なる配列が同様の構造を持つ場合があります。一方、アブ イニシオ法は、分子生物学における最大の問題の 1 つ、つまり相同配列や構造を使用せずに「ゼロから」タンパク質のフォールディングを予測するという問題に挑戦します。著者らは、「SAXS フィルター」を使用して、de novo タンパク質モデルのセットを大幅に精製することができました。^{[17]これは、構造}相同性検索によってさらに証明されました。また、SAXSスコアとスレッド法で使用されるスコアを組み合わせると、フォールド認識のパフォーマンスが大幅に向上することも示されました。^[16]ある例では、SAXSデータを使用して、並進自由度を制限しながら、ドメインの高解像度NMR構造からモジュールタンパク質のおおよその三次構造を組み立てる方法が実証されました。^{[18]別の例では、SAXSデータをNMR、} X線結晶構造解析、電子顕微鏡と組み合わせて、マルチドメインタンパク質の四次構造を再構築する方法を示しています。^[19]

最近、柔軟なリンカーを持つ本質的に無秩序なタンパク質やマルチドメインタンパク質の問題に取り組むための優れた方法が提案されました。^[20]この方法では、タンパク質の異なる立体配座の共存が可能になり、それらが一緒になって平均実験散乱パターンに寄与します。最初に、EOM (アンサンブル最適化法) によって、タンパク質の配置空間をカバーするモデルのプールが生成されます。次に、各モデルの散乱曲線が計算されます。2 番目のステップでは、プログラムがタンパク質モデルのサブセットを選択します。各サブセットの平均実験散乱が計算され、実験 SAXS データに適合されます。最適な適合が見つからない場合は、モデルが異なるサブセット間で入れ替えられ、新しい平均散乱計算と実験データへの適合が実行されます。この方法は、変性 リゾチームとブルトンのタンパク質キナーゼの2 つのタンパク質でテストされました。興味深く有望な結果が得られました。^[20]

バイオ分子のコーティングは、斜入射 X 線および中性子散乱で研究できます。IsGISAXS (斜入射小角 X 線散乱) は、ナノ構造からのGISAXSのシミュレーションと分析専用のソフトウェア プログラムです。IsGISAXS は、マトリックスの表面下に埋め込まれているか、基板上に支持されているか、基板上の薄層に埋め込まれているナノメートル サイズの粒子による散乱のみを対象としています。穴の場合も処理されます。ジオメトリは粒子の平面に制限されます。散乱断面積は、干渉関数と粒子形状係数に分解されます。「ビーム屈折効果」を引き起こす斜入射ジオメトリに重点が置かれています。粒子形状係数は、歪んだ波ボルン近似(DWBA)内で計算され、鋭い界面を持つ非摂動状態または屈折率の実際の垂直プロファイルから始まります。分離近似（DA）、局所単分散近似（LMA）、サイズ間隔相関近似（SSCA）では、サイズと形状の分布を完全に考慮したさまざまな種類の単純な幾何学的形状が利用可能です。粒子間相関関数によって定義される粒子の無秩序なシステムと、 2次元結晶または準結晶の両方が考慮されます。^[21]

Wikibooksには、 X線結晶構造解析に関する書籍があります。

• SAXS/WAXS ビームラインオーストラリアシンクロトロン、メルボルン、オーストラリア
• SIBYLS –米国バークレーのAdvanced Light Sourceのビームライン
• SAXS –イタリア、トリエステのELETTRA シンクロトロン光研究所のビームライン
• X33 –ドイツ、ハンブルクのDESYのビームライン
• D11A ^{[リンク切れ‍ ]} – ブラジル、カンピナスのブラジルシンクロトロン光研究所のビームライン
• X21 および X9 –米国ブルックヘブン国立研究所の国立シンクロトロン光源のビームライン(アプトン)
• F2 および G1 –米国イサカのコーネル加速器科学教育研究所のビームライン
• Bio-SANS –米国テネシー州オークリッジにあるオークリッジ国立研究所の高フラックス同位体原子炉のビームライン