静的光散乱

静的光散乱は、散乱光の強度を測定して、溶液中のポリマーやタンパク質などの高分子の平均分子量M _wを求める物理化学の技術です。さまざまな角度で散乱強度を測定すると、二乗平均平方根半径（回転半径R _gとも呼ばれます）を計算できます。さまざまな濃度の多くのサンプルの散乱強度を測定することで、第 2 ビリアル係数A ₂を計算できます。^{[1] [2] [3] [4] [5]}

静的光散乱は、それぞれ ローレンツ・ミー（ミー散乱を参照）およびフラウンホーファー回折形式を介して、サブμmおよびスーパーμm範囲の粒子懸濁液のサイズを決定するためにもよく使用されます。

静的光散乱実験では、高強度の単色光（通常はレーザー）を高分子を含む溶液に照射します。1 つまたは複数の検出器を使用して、1 つまたは複数の角度で散乱強度を測定します。入射波長の 1～2% を超える半径を持つすべての高分子のモル質量とサイズの両方を正確に測定するには、角度依存性が必要です。したがって、入射光の方向を基準とした複数の角度での同時測定は、多角度光散乱 (MALS) または多角度レーザー光散乱 (MALLS) と呼ばれ、静的光散乱の標準的な実装と一般に考えられています。MALS の歴史と理論の詳細については、多角度光散乱を参照してください。

光散乱強度から較正せずに平均分子量を直接測定するには、レーザー強度、検出器の量子効率、検出器の全散乱体積と立体角を知る必要があります。これは非現実的であるため、トルエンと他のいくつかの溶媒のレイリー比は絶対光散乱装置を使用して測定されているため、市販の機器はすべて、トルエンなどの強力な既知の散乱体を使用して較正されています。

さまざまな角度で配置された多数の検出器で構成される光散乱装置の場合、すべての検出器が同じように応答する必要があります。通常、検出器は量子効率とゲインがわずかに異なり、異なる幾何学的散乱体積を検出します。この場合、検出器の正規化が絶対に必要です。検出器を正規化するには、まず純粋な溶媒を測定します。次に、等方性散乱体を溶媒に追加します。等方性散乱体はどの角度でも同じ強度を散乱するため、この手順で検出器の効率とゲインを正規化できます。すべての検出器を 90° 角度検出器に正規化するのが便利です。

${\displaystyle \ N(\theta )={\frac {I_{R}(\theta )-I_{S}(\theta )}{I_{R}(90)-I_{S}(90)}}}$

ここで、I _R (90)は、90°角度検出器によって測定されたレイリー散乱体の散乱強度である。

重量平均分子量Mw_を測定する最も一般的な式は、ジム式^[5]である（ジム式の右辺は、ヒエメンツとロッジが指摘しているように、一部の文献では誤って記載されている）：^[6]

${\displaystyle {\frac {Kc}{\Delta R(\theta ,c)}}={\frac {1}{M_{w}}}\left(1+{\frac {q^{2}R_{g}^{2}}{3}}+O(q^{4})\right)+2A_{2}c+O(c^{2})}$

どこ

${\displaystyle \ K=4\pi ^{2}n_{0}^{2}(dn/dc)^{2}/N_{\text{A}}\lambda ^{4}}$

そして

${\displaystyle \ \Delta R(\theta ,c)=R_{A}(\theta )-R_{0}(\theta )}$

と

${\displaystyle \ R(\theta )={\frac {I_{A}(\theta )n_{0}^{2}}{I_{T}(\theta )n_{T}^{2}}}{\frac {R_{T}}{N(\theta )}}}$

垂直偏光の散乱ベクトルは

${\displaystyle \ q=4\pi n_{0}\sin(\theta /2)/\lambda }$

ここで、n ₀は溶媒の屈折率、λ は光源の波長、N _{A は}アボガドロ定数、cは溶液の濃度、d n /d c は濃度の変化による溶液の屈折率の変化です。角度で測定された分析物の強度はI _A (θ)です。これらの式で、下付き文字 A は分析物（溶液）を表し、T はトルエンを表します。トルエンのレイリー比R _TはHeNe レーザーの場合1.35×10 ⁻⁵  cm ⁻¹です。前述のように、回転半径R _gと第 2 ビリアル係数A ₂もこの式から計算されます。屈折率の増分dn/dc は濃度cによる屈折率nの変化を表し、示差屈折計で測定できます。

ジム プロットは、さまざまな角度とさまざまな濃度測定から、角度 0 と濃度 0 への二重外挿によって作成されます。最も単純な形式では、ジム方程式は次のように簡略化されます。

${\displaystyle \ Kc/\Delta R(\theta \rightarrow 0,c\rightarrow 0)=1/M_{w}}$

P (0) = 1 なので、低角度および無限希釈で行われた測定の場合。

一般的に、溶液中の粒子の散乱を分析して、粒子の上記の物理的特性を導き出すために、いくつかの分析が開発されています。単純な静的光散乱実験では、溶媒の散乱を補正したサンプルの平均強度から、角度または波数ベクトルqの関数として、レイリー比R が次のように得られます。

散乱強度は角度の関数としてプロットすることができ、R _gに関する情報が得られます。これは、次のように ギニエ近似を使用して簡単に計算できます。

${\displaystyle \ln(\Delta R(\theta ))=1-(R_{g}^{2}/3)q^{2}}$

ここで、ln(ΔR(θ)) = lnP(θ) は、q = 4πn ₀ sin(θ/2)/λの形状係数としても知られています。したがって、補正レイリー比ΔR(θ) 対 sin ² (θ/2)またはq ²のプロットは、傾きR _g ² /3になります。ただし、この近似はqR _g < 1の場合にのみ当てはまります。ギニエ プロットの場合、 dn/dcの値と濃度は必要ないことに注意してください。

Kratkyプロットは、通常、タンパク質の立体配座を分析するために使用されますが、ポリマーのランダム ウォークモデルの分析にも使用できます。Kratky プロットは、 sin ² (θ/2)ΔR( θ ) vs sin(θ/2)またはq ² ΔR(θ) vs qをプロットすることで作成できます。

静的光散乱によって単分散（ ）であると判定されたポリマーおよびポリマー複合体の場合、ジムプロットは、 R _g、分子量M _w、第2ビリアル係数A ₂などのパラメータを導出する従来の手段です。 ${\displaystyle \scriptstyle \mu _{2}/{\bar {\Gamma }}^{2}<0.3}$

材料定数Kが実装されていない場合、Zimm プロットではR _gのみが得られることに注意してください。したがって、K を実装すると、次の式が得られます。

${\displaystyle {\frac {Kc}{\Delta R(\theta ,c)}}={\frac {1}{M_{w}}}\left(1+{\frac {q^{2}R_{g}^{2}}{3}}+O(q^{4})\right)+2A_{2}c+O(c^{2})}$

Zimm プロットで実行される分析では、ゼロ濃度およびゼロ散乱角への二重外挿を使用し、特徴的な菱形プロットが得られます。角度情報が利用できるため、回転半径 ( R _g ) を取得することもできます。実験は、条件と少なくとも 4 つの濃度を満たすいくつかの角度で実行されます。単一の濃度で Zimm 分析を実行することは、部分 Zimm 分析と呼ばれ、強い点散乱体の希薄溶液に対してのみ有効です。ただし、部分 Zimm では、サンプルの可変濃度がないため、第 2ビリアル係数は得られません。より具体的には、第 2 ビリアル係数の値は、ゼロに等しいと想定されるか、または部分 Zimm 分析を実行するために既知の値として入力されます。 ${\displaystyle qR_{g}<1}$

測定粒子がλ/20より小さい場合、形状係数P(θ)は無視できます（P(θ) →1）。したがって、ジム方程式は次のようにデバイ方程式に簡略化されます。

${\displaystyle {\frac {Kc}{\Delta R(\theta ,c)}}={\frac {1}{M_{w}}}+2A_{2}c}$

これは、散乱角ゼロへの外挿の結果でもあることに注意してください。濃度と散乱強度のデータを取得して、Kc / ΔR(θ)対濃度をプロットすることで、デバイ プロットが作成されます。近似直線の切片は分子量を示し、傾きは 2 番目のビリアル係数に対応します。

デバイプロットはジム方程式を簡略化したものであるため、後者と同じ制限が適用されます。つまり、サンプルは単分散性を示す必要があります。多分散サンプルの場合、静的光散乱測定から得られる分子量は平均値を表します。デバイプロットの利点は、第 2 ビリアル係数を決定できることです。このパラメーターは、粒子と溶媒の相互作用を表します。たとえば、高分子溶液では、負の値 (粒子間相互作用が優先)、ゼロ、または正の値 (粒子と溶媒の相互作用が優先) を取ることができます。^[8]

静的光散乱では、検出された各光子は正確に 1 回だけ散乱されたと仮定します。したがって、上記の計算による分析は、サンプルが十分に希釈され、光子が検出される前にサンプルによって複数回散乱されないことが保証されている場合にのみ正確になります。多重散乱による影響が無視できないシステムでは、正確な解釈が非常に難しくなります。散乱信号の分析が自動的に実行される多くの市販の機器では、ユーザーがエラーに気付かない場合があります。特に、より大きな粒子や屈折率のコントラストが高い粒子の場合、標準的な静的光散乱の適用は非常に低い粒子濃度に制限されます。一方、溶媒に対して比較的低い屈折率のコントラストを示す可溶性高分子 (それぞれの溶媒中のほとんどのポリマーと生体分子を含む) の場合、溶解度の限界に近い濃度であっても、多重散乱が制限要因になることはほとんどありません。

しかし、Schaetzel が示したように、^[9]相互相関アプローチにより静的光散乱実験における多重散乱を抑制することが可能です。一般的な考え方は、静的光散乱実験において、単一散乱光を分離し、多重散乱からの望ましくない寄与を抑制することです。相互相関光散乱のさまざまな実装が開発され、適用されてきました。現在、最も広く使用されている方式は、いわゆる 3D 動的光散乱法です。^{[10] [11]同じ方法を使用して、多重散乱寄与に対する}動的光散乱データを補正することもできます。^[12]

希釈後に特性が変化するサンプルは、ここで Zimm 方程式として提示されている単純なモデルに基づく静的光散乱では分析できない可能性があります。より高度な分析である「組成勾配静的 (または多角度) 光散乱」(CG-SLS または CG-MALS) は、タンパク質間相互作用、凝集特性、およびその他の高分子相互作用を調査するための重要な手法の 1 つです。この分析では、サイズと分子量に加えて、1 つ以上の会合する高分子/生体分子種によって形成される分子複合体の親和性および化学量論に関する情報が得られます。特に、希釈系列からの静的光散乱を分析して、自己会合、可逆的オリゴマー化、および非特異的引力または反発力を定量化できます。一方、種の混合物からの静的光散乱を分析して、ヘテロ会合を定量化できます。^[13]

静的光散乱による分子量測定の主な用途の1つは、タンパク質やポリマーなどの高分子の分野です。^{[14] [15] [16]}タンパク質の形状を仮定せずに分子量を測定できるためです。静的光散乱は通常、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）、動的光散乱（DLS）、電気泳動光散乱（ELS）などの他の粒子特性評価技術と組み合わせて使用​​されます。

• 微分静的光散乱（DSLS）
• 動的光散乱
• 光の散乱
• タンパク質間相互作用

• 静的光散乱の応用
• ライトサイザー