二分子蛍光補完

二分子蛍光相補性（ BiFCとも呼ばれる）は、タンパク質相互作用の検証に一般的に使用される技術です。これは、同じ高分子複合体の成分に付着した蛍光タンパク質フラグメントの結合に基づいています。相互作用すると想定されるタンパク質は、蛍光レポータータンパク質の折り畳まれていない相補フラグメントに融合され、生細胞で発現されます。これらのタンパク質の相互作用により、蛍光フラグメントが近接し、レポータータンパク質が本来の 3 次元構造に再形成され、蛍光信号を発することができます。^[1]この蛍光シグナルは、細胞内の蛍光を画像化できる倒立蛍光顕微鏡を使用して、細胞内で検出および配置できます。さらに、放出される蛍光の強度は相互作用の強さに比例し、蛍光レベルが強いほど密接または直接的な相互作用を示し、蛍光レベルが低いほど複合体内での相互作用を示唆します。^[2]したがって、これらの細胞内の蛍光の強度と分布を視覚化して分析することで、目的のタンパク質の位置と相互作用パートナーの両方を特定できます。

生化学的補完は、サブチリシン切断ウシ膵臓リボヌクレアーゼで最初に報告され、その後、細胞がラクトース上で増殖することを可能にするβ-ガラクトシダーゼ変異体を使用して拡大されました。 ^{[3] [4] [5]}

多くのタンパク質が自発的に機能的複合体に組み立てられる能力と、タンパク質断片が融合した相互作用パートナーの自発的な機能的複合体の組み立ての結果として組み立てられる能力が認識され、その後、酵母タンパク質相互作用におけるユビキチン断片について報告されました。 ^[6]

2000年に、Ghoshらは、大腸菌細胞内で反平行ロイシンジッパーを用いて緑色蛍光タンパク質（GFP）を再構成できるシステムを開発しました。 ^{[7]これは、GFPを}C末端およびN末端のGFP断片に分解することによって達成されました。GFP断片はリンカーによって各ロイシンジッパーに結合しているため、反平行ロイシンジッパーのヘテロ二量体化により、再構成または再形成されたGFPタンパク質が得られ、これを視覚化できました。蛍光シグナルが成功したことは、個別のGFPペプチド断片が正しく再構成され、三次折り畳みを達成できたことを示しています。したがって、この技術を使用することで、断片化されたGFPを使用して、 N末端とC末端が近接している タンパク質間ペアの相互作用を研究できると仮定されました。

哺乳類細胞における蛍光タンパク質断片の再構成が成功したことを実証した後、Huらは、断片化された黄色蛍光タンパク質（YFP ）を使用したbZIPおよびRelファミリー転写因子相互作用の研究について報告した。^[8]これは、bZIPドメイン外の領域によるbZIPタンパク質相互作用の調節、異なる相互作用パートナーによるbZIPドメインFosおよびJunの核内局在の調節、および相互相互作用によるbZIPおよびRelタンパク質の転写活性化の調節に関する最初の報告であった。さらに、この研究は、相互作用タンパク質に結合した蛍光レポータータンパク質断片のアセンブリによって引き起こされる蛍光を検出することにより、タンパク質複合体形成の構造的基礎に関する洞察を提供する、現在では二分子蛍光補完（BiFC）アッセイとして知られるin vivo技術の最初の報告であった。^{[8] [9]}

蛍光体の活性化は、タンパク質が正しく折り畳まれた後に起こる自己触媒環化反応によって起こります。^[10]これは、2002年に報告された、トランスフェクション後8時間以内に相互作用タンパク質に融合されたタンパク質断片からのYFP蛍光体の再構成の成功によって進歩しました。^[8]

生成された融合タンパク質には、さまざまな生産システムを使用できます。一過性遺伝子発現は、生体内および BiFC 複合体の細胞内局在におけるタンパク質間相互作用の特定に使用されます。ただし、タンパク質の過剰発現には注意が必要です。過剰発現は、優先的な局在と形成される主要なタンパク質複合体の両方を歪める可能性があるためです。代わりに、弱いプロモーター、トランスフェクションにおける低レベルのプラスミド DNA の使用、および哺乳類細胞で複製されないプラスミドベクターを使用して、内因性レベルまたはそれに近いレベルでタンパク質を発現し、生理学的細胞環境を模倣する必要があります。^[11]また、蛍光タンパク質を慎重に選択することも重要です。異なる蛍光タンパク質には異なる細胞環境が必要になるためです。たとえば、GFP は大腸菌細胞で使用できますが、YFP は哺乳類細胞で使用されます。^[12]

発現ベクターがゲノムに組み込まれた安定した細胞株は、細胞集団内でより安定した遺伝子発現を可能にし、より一貫した結果をもたらします。 ^[1]

タンパク質表面上のリンカー融合部位を決定する際には、主に 3 つの考慮事項があります。まず、蛍光タンパク質フラグメントは、結合したタンパク質が相互作用するときに互いに結合できる必要があります。^[11]構造情報と相互作用表面の位置は、リンカーへの融合部位を決定する際に役立つ場合がありますが、複数の組み合わせと順列をスクリーニングできるため、この情報は必須ではありません。^[11]次に、融合タンパク質の作成により、フラグメントが結合するタンパク質の局在、安定性、または発現が、内因性の 野生型タンパク質と比較して大幅に変化してはなりません。^[11]最後に、蛍光フラグメント融合の追加は、タンパク質の生物学的機能に影響を与えてはならず、タンパク質の既知の機能すべてを評価するアッセイを使用して検証されることが望ましいです。^[11]

リンカーは、蛍光レポータータンパク質フラグメントを目的のタンパク質につなぎ、融合タンパク質を形成する短いアミノ酸配列です。リンカー配列を設計する際は、蛍光タンパク質フラグメントに柔軟性と動きの自由度を与えるのに十分な可溶性と長さのリンカーを確保する必要があります。これにより、フラグメントとそのパートナーフラグメントは、それぞれの融合タンパク質の相互作用中に再構成されるのに十分な頻度で衝突します。^[1]文書化されていませんが、リンカーの長さや配列が一部のタンパク質の補完に影響を与える可能性があります。^[11]報告されているリンカー配列 RSIAT および RPACKIPNDLKQKVMNH (単一アミノ酸コード) および AAANSSIDLISVPVDSR (Sigma) は、BiFC 実験で効果的に使用されています。^{[8] [13]}

目的のタンパク質を発現するプラスミドベクターを設計する場合、その構築物は、タンパク質の機能を阻害することなく蛍光タンパク質フラグメントと融合タンパク質を形成できるタンパク質を発現できなければなりません。さらに、予想されるタンパク質複合体は、タンパク質複合体の機能や研究対象の細胞に影響を与えることなく、蛍光タンパク質フラグメントの相互作用の安定化を受け入れることができなければなりません。さまざまな方法で結合する多くの蛍光タンパク質フラグメントを BiFC で使用できます。^{[8] [13]一般に、YFP は、}残基155 (N 末端は残基 1～154 で構成され、C 末端は残基 155～238 で構成される) または特に残基 173で切断され、レポータータンパク質として機能することが推奨されています。これは、これらのフラグメントのセットは、多くの相互作用するタンパク質と融合した場合に補完性が非常に効率的であり、相互作用しないタンパク質と融合した場合に低レベルの蛍光を生成するためです。各標的タンパク質は蛍光レポータータンパク質のN末端フラグメントとC末端フラグメントの両方に順番に融合され、フラグメントは標的タンパク質のN末端とC末端のそれぞれに融合されることが示唆されている。これにより、合計8つの異なる組み合わせが可能になり、相互作用がテストされる：^[1]

N 末端タンパク質 1 に融合した N 末端フラグメント + N 末端タンパク質 2 に融合した C 末端
フラグメント N 末端タンパク質 1 に融合した N 末端フラグメント + C 末端タンパク質 2 に融合した
N 末端フラグメント C 末端タンパク質 1 に融合した N 末端フラグメント + C 末端タンパク質 2 に融合した N 末端フラグメント C 末端タンパク質 1
に融合した N 末端フラグメント + C 末端タンパク質 2 に融合した N 末端フラグメント C 末端タンパク質 1 に
融合した N 末端フラグメント + C 末端タンパク質 2 に融合した C 末端フラグメント N 末端タンパク質 1 に融合した N 末端フラグメント +
C 末端タンパク質 2 に融合した N 末端フラグメント C 末端タンパク質 1 に融合した N 末端フラグメント + C 末端タンパク質 2
に融合した N 末端フラグメント C 末端タンパク質 1 に融合した N 末端フラグメント + N 末端タンパク質 2
に融合した C 末端フラグメントC末端タンパク質1 + C末端タンパク質2で融合したN末端フラグメント

前述のように、すべてのレポータータンパク質がすべてのモデルシステムで蛍光を発したり可視化できるわけではないため、BiFC で使用される蛍光レポータータンパク質が適切であり、選択した細胞培養システムで発現できることを確認することが重要です。

蛍光タンパク質断片は、特異的な相互作用がない場合、低効率で会合して蛍光を発する可能性がある。したがって、蛍光レポータータンパク質再構成からの蛍光が非特異的な接触によるものではないことを確認するために、コントロールを含めることが重要である。 ^[14]

いくつかのコントロールには、相互作用しないタンパク質に結合した蛍光体断片が含まれています。これらの融合体の存在は、非特異的な補完と偽陽性の結果を減少させる傾向があるためです。^[7]

もう一つのコントロールは、蛍光タンパク質フラグメントを変異した相互作用面を持つタンパク質にリンクさせることによって作成されます。^{[8] [13]蛍光フラグメントが野生型タンパク質と同じ方法で変異タンパク質に融合され、遺伝子発現レベルと局在が}変異の影響を受けない限り、これは強力なネガティブコントロールとして機能します。なぜなら、変異タンパク質、したがって蛍光フラグメントは相互作用できないからです。

異なる細胞におけるトランスフェクション効率と遺伝子発現の差を標準化するためにも、内部コントロールが必要です。これは、目的の融合タンパク質をコードするプラスミドと、蛍光レポータータンパク質とは異なる波長で蛍光を発するタンパク質全体（断片化されていない）を細胞に共トランスフェクトすることで実現します。可視化中に、BiFC複合体と内部コントロールの蛍光強度を測定し、バックグラウンド信号を差し引いた後に比率を求めます。この比率はBiFC効率を表し、他の比率と比較して、異なる複合体の形成の相対的な効率を決定できます。^[11]

融合タンパク質とコントロールが適切な発現システムで設計され生成されたら、プラスミドを研究対象の細胞に導入する必要があります。導入後、融合タンパク質が相互作用し、リンクされた蛍光レポータータンパク質フラグメントが結合して蛍光を発するまで、通常約8時間待つ必要があります。^[8]

融合タンパク質とそれに結合した蛍光フラグメントが相互作用して蛍光を発するのに十分な時間が経過した後、細胞は細胞内の蛍光を可視化できる倒立蛍光顕微鏡で観察できます。BiFC複合体の蛍光強度は通常、完全な蛍光タンパク質の発現によって生成される強度の10％未満ですが、ほとんどの細胞では可視範囲での自己蛍光が極めて低いため、BiFC信号は背景蛍光よりも桁違いに高くなります。^[15]

融合タンパク質が発現したときに蛍光が検出され、変異したネガティブ コントロールの発現後に蛍光が欠如または大幅に減少した場合、対象の 2 つのターゲット タンパク質間で特定の相互作用が発生している可能性があります。ただし、変異したネガティブ コントロール融合タンパク質とその野生型対応物との間で蛍光強度に大きな差がない場合は、蛍光は非特異的なタンパク質相互作用によって引き起こされている可能性が高いため、融合タンパク質構造の異なる組み合わせをテストする必要があります。

蛍光が検出されない場合、融合タンパク質の生成によって標的タンパク質の構造または相互作用面が変化するか、蛍光フラグメントが物理的に会合できない可能性があるため、目的のタンパク質間に相互作用がまだ存在する可能性があります。この結果が偽陰性ではなく、相互作用がないことを確認するには、蛍光補完および活性化に外部信号が必要な状況でタンパク質相互作用をテストする必要があります。この場合、外部信号が蛍光フラグメントの会合を引き起こさない場合は、タンパク質が相互作用していないか、蛍光補完に物理的な障害がある可能性があります。^[11]

タンパク質は、さまざまなタンパク質パートナーや他の高分子と相互作用して、生物の生存を支える細胞内のさまざまな機能を実現します。これらの相互作用を特定することで、細胞プロセスへの影響についての手がかりが得られる可能性があります。これらの相互作用は内部環境と外部刺激の両方の影響を受ける可能性があるため、BiFC で推奨されているように、これらの相互作用を生体内で内因性レベルで研究することで、タンパク質相互作用に関する結論を導き出すための生理学的に関連するコンテキストが得られます。

BiFCは、二次的効果や均一に分布しない可能性のある外因性分子による染色に頼るのではなく、限られた細胞摂動で生細胞内のタンパク質相互作用を直接可視化することを可能にします。 ^[1]これと、生細胞を長期間観察する能力は、再構成されたレポータータンパク質の強い固有蛍光によって可能になり、タンパク質分離プロセスに関連する誤った読み取りの可能性が減ります。^{[1] [16]}

多くの生体内タンパク質相互作用アッセイとは異なり、BiFC では、タンパク質複合体が大部分のタンパク質によって、または化学量論的割合で形成される必要はありません。代わりに、BiFC は、蛍光レポータータンパク質の安定した補完により、タンパク質サブポピュレーション間の相互作用、弱い相互作用、および低発現タンパク質を検出できます。^{[12] [17]}さらに、蛍光体フラグメントを目的のタンパク質に結合するリンカーが、対応するフラグメントと結合するために必要な柔軟性を持っている限り、7 nm 以上離れたタンパク質パートナーに対しても蛍光タンパク質の再構成が成功したことが報告されています。^[14] さらに、タンパク質相互作用の強さは、蛍光信号強度の変化によって定量的に決定できます。^[2]

BiFCは、活性化薬剤や阻害薬剤への反応や細胞内におけるタンパク質複合体の空間的および時間的変化の測定を可能にし、生体内タンパク質間相互作用アッセイで最高の空間分解能を提供します。 ^{[8] [18] [19]}

BiFCは細胞内の蛍光を検出できる倒立蛍光顕微鏡で可視化できるため、特殊な機器は必要ありません。^[14]さらに、分析には複雑なデータ処理や他の蛍光源の補正は必要ありません。^[8]

BiFCは、蛍光レポータータンパク質断片が複合体内で結合できる限り、相互作用パートナーの構造情報がなくても実行でき、融合タンパク質の複数の組み合わせをスクリーニングできます。これは、タンパク質の機能が生体内で再現されるため、複合体の構造は生理学的に見られる完全なタンパク質の構造に似ているという仮定によるものです。^[15]

BiFC技術は改良され、同じ細胞内の複数のタンパク質複合体、RNA/タンパク質相互作用を同時に視覚化する機能、遺伝子導入経路の変化を迅速に検出する機能、予測される治療結果（細胞死、分化、形態変化など）が生体内では見られない場合の薬物の隠れた表現型を示す機能、異なる細胞区画での複合体形成を研究する機能、タンパク質相互作用表面をマッピングする機能などが追加されました^{[13] [19] [20] [21] [22]}

蛍光シグナルはタンパク質が相互作用した後にのみ生成され、通常は数時間かかります。そのため、BiFC ではタンパク質相互作用をリアルタイムで検出することはできません。蛍光体を生成する化学反応の遅延は、複合体の解離とパートナー交換のダイナミクスにも影響を及ぼす可能性があります。^{[1] [7] [8] [23]}

BiFC複合体の形成は、蛍光レポータータンパク質の再構成の初期段階でのみ可逆的であり、通常は数ミリ秒のオーダーです。蛍光色素が再構成されると、in vitroでは基本的に不可逆です。これにより、タンパク質が他のタンパク質と相互作用することが妨げられ、動的平衡におけるタンパク質複合体の会合/解離が阻害される可能性があります。^[1]

蛍光タンパク質断片は、融合されているタンパク質とは独立して結合する能力が限られています。タンパク質に依存しない結合は融合タンパク質の種類や発現レベルによって異なりますが、真陽性と偽陽性のタンパク質相互作用を区別するために必要な多数のコントロールを用意する必要があります。通常、この制限は、目的の融合タンパク質が内因性濃度で発現されるようにすることで緩和されます。^[1]

蛍光フラグメントの結合により、目的のタンパク質の折り畳みや構造が変化し、相互作用するタンパク質の表面結合部位が除去される可能性があります。さらに、蛍光フラグメントの配置により、立体障害によって蛍光体の再構成が妨げられる可能性がありますが、蛍光フラグメントが結合するのに十分な柔軟性を可能にするリンカー配列を使用することで、立体障害を軽減または排除できます。したがって、蛍光補完がないことは偽陰性である可能性があり、必ずしも問題の相互作用が発生しないことを証明するものではありません。

蛍光体形成には分子状酸素が必要であるため、BiFCは酸素の存在下では生存できない偏性嫌気性生物には使用できません。このため、BiFCの使用は好気性生物に限定されます。^[1]

BiFC信号はバックグラウンドよりもはるかに高いため、通常は自己蛍光は問題になりません。^{[24] [25]}しかし、特定の生物、特にアピコンプレックスは自己蛍光が高く、BiFCの適用が難しくなります。^[26]カンジダアルビカンスなどの特定の真菌も自己蛍光バックグラウンドが高いですが、適切なコントロールと株を使用すれば、BiFCを実行できる場合がよくあります。^{[27] [28]}

内因性の野生型タンパク質は生体内では観察できないため、融合タンパク質を作成し、そのプラスミドを研究対象の細胞に導入する必要があります。これらの融合タンパク質は、野生型タンパク質に共通する機能、局在、相互作用を再現しない可能性があり、問題のタンパク質の正確な画像を提供しません。この問題は、構造情報と相互作用部位の位置を使用して目的のタンパク質上の融合部位を合理的に特定し、適切なコントロールを使用し、ウェスタンブロットと機能アッセイを通じて融合タンパク質と野生型タンパク質の発現レベルと機能を比較することで軽減できます。^[1]

低温では断片が近接しているときに蛍光の再構成が促進されるが、これは標的タンパク質の挙動に影響を与え、タンパク質相互作用とその相互作用パートナーの性質に関する不正確な結論につながる可能性がある。^[17]

蛍光体の再構成は7nm以上の距離で起こる可能性があるため、蛍光補完は蛍光断片の融合タンパク質間の直接的または間接的（すなわち同じ複合体内）相互作用を示している可能性がある。^[16]

上で説明したタンパク質間相互作用の検証に加えて、BiFC は他のアプリケーションにも拡張され、適応されています。

BiFCシステムは、大腸菌におけるリボソーム生合成イベントの記録に適用されている。^[29]リボソームの組み立てプロセスには、リボソームタンパク質の核形成が適切な順序と方向で行われる。組み立ての乱れはリボソームサブユニットの構造的欠陥につながる可能性があり、その結果、正しい方向で結合して完全に機能するリボソームを形成できなくなる。したがって、BiFCの出現によって示されるサブユニット結合イベントは、面倒なポリソームプロファイリング法とは対照的に、リボソーム生合成をモニターする簡単な方法である。

BiFCで使用される蛍光タンパク質フラグメントは、青、シアン、緑、黄、赤、チェリー、金星の色を含むように拡張されました。^{[8] [13] [30] [31]}この色の範囲により、多色蛍光補完分析の開発が可能になりました。^[13]この技術により、複数のタンパク質複合体を同じ細胞内で同時に視覚化できます。さらに、タンパク質には通常、多数の代替相互作用パートナーがあります。したがって、異なる蛍光タンパク質のフラグメントを候補タンパク質に融合することにより、異なる蛍光色フラグメントの補完を通じて、複合体形成のための代替相互作用パートナー間の競合を研究できます。^[13]

BiFC は、Rackham と Brown が三分子蛍光相補法 (TriFC) と表現した方法で RNA 結合タンパク質の相互作用の研究を含むように拡張されました。^[20]この方法では、Venus 蛍光タンパク質の断片を対象のmRNAに融合し、相補的な Venus 部分を対象のRNA 結合タンパク質に融合します。BiFC と同様に、mRNA とタンパク質が相互作用すると、Venus タンパク質が再構成されて蛍光を発します。RNA ブリッジ法としても知られるこの方法では、蛍光体と他の相互作用タンパク質がタンパク質と対象の RNA の間にブリッジを形成するため、生きた細胞内での RNA タンパク質相互作用の簡単な検出と位置特定が可能になり、精製化合物の in vitro 分析またはブリッジ分子のRNAi ノックダウンによって検証できる直接的または間接的な RNA タンパク質の関連 (つまり複合体内) を検出する簡単な方法が提供されます。^[20]

BiFCは、遺伝子がコードするタンパク質間の相互作用を測定することで、遺伝子同士やその機能を結び付けるために使用できます。^{[21] [22]このアプリケーションは、新しい経路のリンクを作成できるため、}上流および下流のエフェクターについてほとんど知られていない新しい遺伝子に最適です。さらに、薬物、ホルモン、または目的の遺伝子の削除またはノックダウンの影響、およびタンパク質間相互作用の強度と相互作用の場所の両方に対するその後の影響を数秒以内に観察できます。^{[18] [19]}

BiFCは、複合体の局在を介した核内移行や、膜貫通タンパク質が関与する相互作用の研究に使用されてきた。^{[8] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38]}このように、BiFCは細胞内区画における転写因子の局在を理解する上で重要なツールである。

BiFCはフローサイトメトリー（BiFC-FC）と組み合わせられており、これにより複合体形成に影響を与える部位特異的またはランダムな変異の導入を通じて、タンパク質間相互作用表面をマッピングすることが可能になる。 ^[2]

タンパク質間相互作用の研究に用いられる技術のほとんどは、in vitro法に依存している。残念ながら、細胞環境外の人工システムでタンパク質を研究することは、多くの困難を伴う。例えば、通常の細胞環境からタンパク質を除去する必要があるかもしれない。タンパク質を単離するために必要な処理は、他のタンパク質との相互作用に影響を及ぼす可能性がある。さらに、通常の細胞で起こる細胞内シグナル伝達やメカニズムからタンパク質を単離すると、細胞内および生理学的現象について誤った情報を与える可能性がある。^[1]さらに、in vitro で研究されるタンパク質は、通常の存在レベルとは大きく異なる濃度で研究される場合があり、必ずしも効率的に細胞内に輸送されない可能性があり、または宿主ゲノム内で機能するのに十分な選択性がない可能性がある。^{[39] [40] [41] [42]}最後に、in vitro でタンパク質を研究することによっては、細胞内の特定のタンパク質間相互作用が機能的または生理学的結果に与える影響を判断することはできない。

タンパク質間相互作用の研究に最も一般的に使用されるその他の生体内アッセイには、蛍光共鳴エネルギー移動( FRET ) アッセイと酵母ツーハイブリッド( Y2H ) アッセイがあります。これらのアッセイはそれぞれ、BiFC と比較して長所と短所があります。

蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）は、フェルスター共鳴エネルギー移動、共鳴エネルギー移動（RET）、電子エネルギー移動（EET）とも呼ばれ、励起された（ドナー）発色団または蛍光体（発色団が蛍光性の場合）から近くの受容体へのエネルギー移動に基づいています。この方法では、蛍光体は、相互作用すると仮定される2つのタンパク質に化学的に結合または遺伝的に融合されます。タンパク質が相互作用する場合、蛍光体は空間的に近接します。蛍光体が互いに露出するように配向されている場合（通常は蛍光体-タンパク質結合/融合の設計および構築時に確保されます）、^{励起されたドナー蛍光体からの}エネルギー移動により、蛍光体の蛍光強度または寿命が^変化

酵母ツーハイブリッド（Y2H）は、物理的な（結合）タンパク質間またはタンパク質とDNAの相互作用を検出するために使用できる遺伝子スクリーニング技術です。これは通常、モデル酵母生物であるサッカロミセス・セレビシエに適用されます。これは、例えば転写因子GAL4の結合ドメインに融合された機能（未知）の「ベイト」タンパク質を、相互作用する可能性のあるタンパク質または、例えばGAL4活性化ドメイン（「獲物」）を発現するcDNAライブラリに対してテストします。^{[43] [44]}

• ケルポラ ラボ オンライン – BiFC
• CD Hu博士のプレゼンテーション – 二分子蛍光相補性（BiFC）：原理と応用