GAL4/UAS システム

GAL4-UASシステムは、ショウジョウバエなどの生物における遺伝子発現と機能の研究に使用される生化学的手法です。このシステムは、1988年にHitoshi KakidaniとMark Ptashne ^[1] 、およびNicholas WebsterとPierre Chambon ^[2]が、Gal4がUAS配列に結合すると遺伝子発現が活性化するという発見に基づいています。この方法は、 1993年にAndrea BrandとNorbert Perrimonによってショウジョウバエに導入され^{[3] 、}遺伝子発現を研究するための強力な技術であると考えられています。^[4]このシステムは、酵母転写活性化タンパク質Gal4をコードするGal4遺伝子と、GAL4が特異的に結合して遺伝子転写を活性化するエンハンサーであるUAS（上流活性化配列）の2つの部分で構成されています。

Gal4システムにより、どの細胞が遺伝子またはタンパク質を発現するかを定義する問題と、実験者がこの知識を使って何をしたいかという問題を分離できます。遺伝学者は、モデル生物 (通常はショウジョウバエ) の遺伝子変異体(GAL4 系統)を作成しました。各系統は、動物の組織の一部のサブセットで GAL4 を発現します。たとえば、一部の系統は、筋肉細胞のみ、神経のみ、または触角のみで GAL4 を発現するなどです。特にショウジョウバエの場合、そのような系統が何万もあり、最も有用な系統は、動物の非常に特定のサブセット (たとえば、ショウジョウバエの脳の 2 つの特定の区画を接続するニューロンのみ) でのみ GAL4 を発現します。GAL4 の主な効果は UAS 領域に結合することであり、ほとんどの細胞には UAS 領域がないため (または無害であるため)、これらの細胞に GAL4 が単独で存在してもほとんどまたはまったく影響はありません。

Gal4自体は目に見えず、細胞にほとんど影響を与えないため、このシステムのもう 1 つの必要な部分は「レポーター ライン」です。これらは、目的の遺伝子の隣に特別な UAS 領域を持つハエの系統です。これらの遺伝的指示は動物のすべての細胞で発生しますが、ほとんどの細胞では、その細胞が GAL4 を生成していないため何も起こりません。ただし、GAL4 を生成している細胞では、UAS がアクティブになり、その隣の遺伝子がオンになり、結果として生じるタンパク質の生成が開始されます。これにより、どの細胞が GAL4 を発現しているかが研究者に報告されるため、「レポーター ライン」という用語が使用されていますが、細胞の挙動を操作することを目的とした遺伝子もよく使用されます。

典型的なレポーター遺伝子には以下のものがあります。

• 緑色蛍光タンパク質（GFP）や赤色蛍光タンパク質（RFP）などの蛍光タンパク質は、科学者がどの細胞がGal4を発現しているかを知ることを可能にする。
• チャネルロドプシンは、神経細胞の光感受性を刺激する。
• ハロロドプシンは、逆に光がニューロンの発火を抑制することを可能にする。
• シビレは、ニューロンを遮断しますが、高温（30℃以上）でのみ遮断します。この遺伝子を持つハエは、ニューロンが正常に動作する低温で飼育してテストすることができます。その後、ハエの体温を上げると（ハエは変温動物なので）、これらのニューロンがオフになります。^[5] ハエの行動が変化すれば、これらのニューロンが何をするのかについての強い手がかりが得られます。
• GECI (遺伝子コード化カルシウム指示薬) は、 GCaMPファミリーのタンパク質のメンバーであることが多いです。これらのタンパク質はカルシウムにさらされると蛍光を発します。これは、ほとんどの細胞でニューロンが発火したときに起こります。これにより、科学者は神経系が機能している様子を示す写真や動画を撮影できます。

たとえば、科学者はまず、目的のニューロン セットで GAL4 を発現する GAL4 ラインからハエを選択し、それを GFP を発現するレポーター ラインと交配することによって、ニューロンのクラスを視覚化できます。子孫では、目的の細胞サブセットが GAL4 を作成し、これらの細胞で GAL4 が UAS に結合して、GFP の生成が可能になります。そのため、目的の細胞サブセットは緑色に蛍光を発し、蛍光顕微鏡で追跡できるようになります。次に、これらの細胞が何をするのかを調べるために、実験者は、同じ GAL4 ラインをチャネルロドプシン レポーター ラインと交配して、これらの各細胞でチャネルロドプシンを発現する場合があります。子孫では、選択した細胞だけがチャネルロドプシンを含み、明るい光によってトリガーされます。これで、科学者はこれらの特定の細胞を意のままにトリガーし、結果として生じる動作を調べて、これらの細胞が何をするのかを確認できます。

Gal4は、大まかにDNA結合ドメインと活性化ドメインからなるモジュラータンパク質です。GAL4が結合するUASはCGG-N _{11 -CCGで、Nは任意の}塩基です。 ^[6] GAL4は通常他の生物には存在しない酵母タンパク質ですが、ショウジョウバエ^[7]やヒト細胞などさまざまな生物で転写活性化因子として機能することが示されており、遺伝子発現の同じメカニズムが進化の過程で保存されてきたことを示しています。 ^[2]

ショウジョウバエの研究では、GAL4 遺伝子はネイティブ遺伝子プロモーター、つまりドライバー遺伝子の制御下に置かれ、UAS はターゲット遺伝子の発現を制御します。GAL4 は、ドライバー遺伝子が通常アクティブな細胞でのみ発現します。次に、GAL4 は、UAS が導入された場所でのみ遺伝子転写をアクティブにします。たとえば、GFP (緑色蛍光タンパク質) などの可視マーカーをコードする遺伝子を融合することで、ドライバー遺伝子の発現パターンを決定できます。GAL4 と UAS は通常は存在せず、その発現は細胞内の他のプロセスを妨げないため、ショウジョウバエでの遺伝子発現の研究​​に非常に役立ちます。たとえば、ショウジョウバエの GAL4/UAS 調節トランスジーンは、色素分散因子(PDF)と呼ばれる既知のリズミカルな概日リズム出力に不規則な動作を生み出すためにグリア発現を変更するために使用されています。^{[8]しかし、いくつかの研究では、}ショウジョウバエにおけるGAL4の過剰発現は、本質的には異質なタンパク質に対する免疫反応やストレス反応に関連して、副作用を引き起こす可能性があることが示唆されています。^[9]

GAL4-UASシステムは、ショウジョウバエ以外にもアフリカツメガエル（アフリカツメガエル） ^[10]やゼブラフィッシュ^[11]などの生物における遺伝子発現の研究​​にも利用されている。

GAL4/UAS システムは、2 つのタンパク質間またはタンパク質と DNA 間の相互作用を識別する方法である Two-Hybrid Screeningでも利用されています。

Gal4 の発現は、「交差戦略」によってさらに特定化できます。この戦略では、2 つの異なる GAL4 ライン (たとえば A と B) を、ライン A にある細胞でのみ発現し、ライン B にはない細胞、またはライン A と B の両方にある細胞でのみ発現するように組み合わせることができます。本質的にまばらな GAL4 ラインと組み合わせると、非常に特定の選択が可能になり、多くの場合、単一の細胞タイプに限定されます。欠点は、少なくとも 3 つの独立した挿入部位が必要なため、ラインは異なる独立した挿入部位を使用する必要があり、目的の最終生物を作成するには 1 回の交配では不十分なことです。これは非常に活発な研究分野であり、このような交差戦略は多数あります。そのうちの 2 つを以下で説明します。

ラインAにはあるがラインBにはない細胞でGAL4発現を作り出す一つの方法は、ラインAにGAL4を発現させ、ラインBにGAL4阻害剤であるGal80を発現させることである。したがって、AにはあるがBにはない細胞だけが活性GAL4を持ち、それがレポーター遺伝子を駆動することができる。^{[12] [13]}

A と B の両方に含まれる細胞のみで GAL4 を発現するには、「スプリット GAL4」と呼ばれる技術を使用できます。ライン A は、それ自体では不活性な GAL4 タンパク質の半分を発現するように作られています。同様に、ライン B は、それ自体では不活性な GAL4 のもう半分を発現するように作られています。両方のラインにある細胞だけが両方の半分を作り、ロイシンジッパーによってGAL4 に自己集合し、レポーター遺伝子を活性化します。^[14]