核酸類似体

核酸類似体は、天然のRNAやDNAに類似（構造が類似）した化合物で、医療や分子生物学の研究に使用されています。 核酸はヌクレオチドの鎖で、リン酸骨格、ペントース糖（リボースまたはデオキシリボース）、4つの核酸塩基のうちの1つの3つの部分で構成されています。類似体は、これらのいずれかが変更されている可能性があります。^[1]通常、類似体核酸塩基は、とりわけ、異なる塩基対形成特性や塩基スタッキング特性を付与します。例としては、4つの標準塩基すべてと対をなすことができるユニバーサル塩基や、鎖の特性に影響を与えるPNAなどのリン酸-糖骨格類似体（PNAは三重らせんを形成することさえできます）があります。^[2] 核酸類似体は異種核酸とも呼ばれ、代替生化学に基づいて自然界に存在しない生命体を設計する異種生物学 の主要な柱の1つです。

人工核酸には、ペプチド核酸(PNA)、モルフォリノ核酸、ロック核酸(LNA)、グリコール核酸(GNA)、トレオース核酸(TNA)、ヘキシトール核酸 (HNA) などがあります。これらはいずれも、分子の骨格が変化している点で、天然の DNA や RNA と区別されます。ただし、遺伝子のポリ電解質理論では、遺伝子分子が機能するには荷電した骨格が必要であるとされています。

2014 年 5 月、研究者らは、細菌の DNA に 2 つの新しい人工ヌクレオチドを導入することに成功し、個々の人工ヌクレオチドを培養培地に含めることで細菌を 24 回継代培養できたと発表しました。人工ヌクレオチドを利用できる mRNA やタンパク質は生成されませんでした。人工ヌクレオチドは、2 つの縮合芳香族環を特徴としていました。

いくつかのヌクレオシド類似体は、抗ウイルス剤や抗癌剤として使用されています。ウイルスポリメラーゼは、これらの化合物を非標準塩基と結合します。これらの化合物は、細胞内でヌクレオチドに変換されて活性化されます。荷電ヌクレオチドは細胞膜を容易に通過できないため、ヌクレオシドとして投与されます。^{[引用が必要]}

核酸類似体は分子生物学においていくつかの目的で使用されます。

• 生命の起源に関する可能性のあるシナリオの調査：研究者はさまざまな類似物をテストすることで、生命がDNAとRNAを使用するようになったのは、その利点のため時間をかけて選択されたのか、それとも偶然に選択されたのかという疑問に答えようとしています。^[3]
• 特定の配列を検出するツールとして：XNAは、幅広いDNAおよびRNA成分を高い特異性と精度でタグ付けおよび識別するために使用できます。^[4]
• DNA、RNA、XNA基質に作用する酵素として、XNAはRNAリボザイムの作用と同様にDNA、RNA、その他のXNA分子を切断および連結する能力があることが示されている。^[3]
• RNA加水分解に対する耐性を持つツールとして;
• 酵素が使用するメカニズムの調査
• 核酸の構造的特徴の調査。

リボースの 2' ヒドロキシ基はリン酸結合した 3' ヒドロキシ基と反応し、RNA は不安定になりすぎて使用または確実に合成できなくなります。これを克服するために、リボース類似体を使用することができます。最も一般的な RNA 類似体は、2'-O-メチル置換 RNA、ロック核酸(LNA) またはブリッジ核酸(BNA)、モルホリノ、^{[5] [6]}およびペプチド核酸 ( PNA ) です。これらのオリゴヌクレオチドは、異なるバックボーン糖 (PNA の場合は、リボースリン酸の代わりにアミノ酸残基) を持っていますが、それでもワトソンとクリックのペアリングに従って RNA または DNA に結合し、ヌクレアーゼ活性の影響を受けません。これらは酵素的に合成することはできず、ホスホラミダイト戦略を使用して合成するか、PNA の場合は他のペプチド合成方法を使用してのみ得ることができます。^{[出典が必要]}

ジデオキシヌクレオチドは、シーケンシングに使用されます。これらのヌクレオシド三リン酸は、非標準的な糖であるジデオキシリボースを有し、これは DNA に通常存在する 3' ヒドロキシル基を欠いているため、次の塩基と結合できません。3' ヒドロキシル基の欠落により、DNA ポリメラーゼがこれを通常のデオキシリボヌクレオチドと誤認し、連鎖反応が停止します。3' ヒドロキシル基を欠き、アデノシンを模倣する別の連鎖停止類似体は、コルジセピンと呼ばれます。コルジセピンは、 RNA複製を標的とする抗がん剤です。シーケンシングにおける別の類似体は、核酸塩基類似体である 7-デアザ-GTP であり、CG に富む領域のシーケンシングに使用されます。代わりに、7-デアザ-ATP は抗生物質であるツベルシジンと呼ばれます。^{[引用が必要]}

RNAワールドの前には「RNAのような世界」があり、そこにはGNA、PNA、TNAなど異なる骨格を持つ他の核酸が存在していた可能性が示唆されているが、この仮説の証拠は「薄弱」であると言われている。^[7]

天然に存在する塩基は、その構造に応じて 2 つのクラスに分けられます。

• ピリミジンは、 1 位と 3 位に窒素原子を持つ 6 員複素環です。
• プリンは二環式であり、イミダゾール環に融合したピリミジンで構成されています。

人工ヌクレオチド（d5SICS UBPおよびdNaM UBPと呼ばれる非天然塩基対（UBP））が細菌DNAに挿入されているが、これらの遺伝子はmRNAをテンプレート化せず、タンパク質合成を誘導しなかった。人工ヌクレオチドは、天然の（dG-dC）塩基対を模倣した（d5SICS-dNaM）複合体を形成する2つの融合芳香族環を特徴としていた。^{[8] [9] [10]}

最も一般的な塩基類似体の 1 つは5-ブロモウラシル(5BU) で、これは変異誘発性ヌクレオチド類似体 BrdU に見られる異常塩基です。5-ブロモウラシルを含むヌクレオチドが DNA に組み込まれると、アデニンと対になる可能性が最も高くなりますが、別の核酸塩基であるグアニンと対になる別の異性体に自発的に変化する可能性があります。これがDNA複製中に発生すると、反対の塩基類似体としてグアニンが挿入され、次の DNA 複製でそのグアニンはシトシンと対になります。これにより、DNA の 1 つの塩基対が変化し、具体的には遷移変異が発生します。^{[引用が必要]}

さらに、亜硝​​酸 (HNO2) は、複製中の DNA と非複製中の DNA の両方に作用する強力な変異原です。亜硝酸は、アデニン、グアニン、シトシンのアミノ基の脱アミノ化を引き起こします。アデニンは脱アミノ化されてヒポキサンチンとなり、チミンではなくシトシンと塩基対を形成します。シトシンは脱アミノ化されてウラシルとなり、グアニンではなくアデニンと塩基対を形成します。グアニンの脱アミノ化は変異原性ではありません。亜硝酸によって誘発される変異は、野生型に戻るようにも誘発されます。^{[引用が必要]}

一般的に、蛍光体（ローダミンやフルオレセインなど）は、柔軟なアームを介して糖に結合した環（パラ）に結合しており、おそらくはらせんの主溝から突き出ている。[Taqポリメラーゼ]によって蛍光体などのかさばる付加物に結合したヌクレオチドのプロセッシング性が低いため、配列は通常、アームを持つヌクレオチドを使用してコピーされ、後で反応性蛍光体と結合される（間接標識）。

• アミン反応性:アミノアリルヌクレオチドには、シアニンやAlexa Fluor染料などのアミノ反応性染料と反応するリンカー上の第一級アミン基が含まれており、スクシンイミジルエステル (NHS) などの反応性脱離基が含まれています。塩基対形成アミノ基は影響を受けません。
• チオール反応性: チオール含有ヌクレオチドは、マレイミドのような反応性脱離基に結合した蛍光体と反応します。
• ビオチン結合ヌクレオチドは、同じ間接標識原理（および蛍光ストレプトアビジン）に依存しており、Affymetrix DNA チップで使用されます。

蛍光体は医学や生化学の分野で さまざまな用途に使用されています。

最も一般的に使用され、市販されている蛍光塩基類似体である2-アミノプリン（2-AP）は、溶液中で遊離した状態では高い蛍光量子収率（0.68）を示し、核酸に組み込まれると大幅に低下します（約100倍ですが、塩基配列に大きく依存します）。^[11] 2-APのすぐ近くの環境に対する発光感度は、3-MI、6-MI、6-MAP、^[12]ピロロ-dC（市販されている）、^[13]ピロロ-dCの修飾および改良された誘導体、^[14]フラン修飾塩基^[15]など、他の有望で有用な蛍光塩基類似体にも共通しています（最近のレビューを参照）。^{[16] [17] [18] [19] [20]}この微小環境に対する感度は、DNAとRNAの両方における構造とダイナミクス、DNA-タンパク質相互作用のダイナミクスと速度論、DNA内の電子移動などの研究に利用されています。^[要出典]

蛍光量子収率が周囲の塩基の影響をほとんど受けない、新しく開発された非常に興味深い蛍光塩基類似体のグループが、三環式シトシンファミリーです。1,3-ジアザ-2-オキソフェノチアジン（tC）は、周囲の塩基に関係なく、一本鎖でも二本鎖でも蛍光量子収率が約0.2です。^{[21] [22]}また、tCのオキソ同族体であるtC ^O（どちらも市販されている）である1,3-ジアザ-2-オキソフェノキサジンは、二本鎖システムで量子収率が0.2です。^[23]ただし、一本鎖では周囲の塩基の影響を多少受けます（量子収率0.14～0.41）。これらの塩基類似体は、量子収率が高く安定しているため非常に明るく、優れた塩基類似体特性（DNAの構造と安定性がほとんど変わらない）と相まって、他の蛍光塩基類似体では精度が低い蛍光異方性測定やFRET測定に特に有用です。また、同じシトシン類似体ファミリーでは、FRETアクセプター塩基類似体tC_ニトロが開発されています。^{[24] FRETドナーとしてのtC O}とともに、これはこれまでに開発された最初の核酸塩基類似体FRETペアを構成します。たとえば、tCファミリーは、ポリメラーゼDNA結合およびDNA重合メカニズムに関連する研究に使用されています。

細胞内には、DNA の CpG アイランド (メチル化されていることが多い)、すべての真核生物の mRNA (メチル-7-グアノシンでキャップされている)、および rRNA のいくつかの塩基 (メチル化されている) など、いくつかの非標準的な塩基が存在します。多くの場合、tRNA は、特にアンチコドン内またはその近くで、その構造や塩基対合を改善するために、転写後に大幅に修飾されます。イノシンはC、U、さらには A と塩基対合することができますが、チオウリジン (A と) はウラシル (プリンと) よりも特異的です。^{[25]その他の一般的な tRNA 塩基修飾には、シュードウリジン (} TΨC ループの名前の由来)、ジヒドロウリジン (芳香族ではないためスタックしない)、キューオシン、ワイオシンなどがあります。ただし、これらはすべて通常の塩基に対する修飾であり、ポリメラーゼによって行われるものではありません。 ^[25]

標準的な塩基は、グリコシド結合から最も遠い窒素原子を囲む炭素上にカルボニル基またはアミン基のいずれかを持ち、これにより水素結合（アミンとケトン、プリンとピリミジン）を介して塩基対（ワトソン・クリック塩基対）を形成できる。アデニンと 2-アミノアデニンは 1 つまたは 2 つのアミン基を持ち、チミンは 2 つのカルボニル基を持ち、シトシンとグアニンはアミンとカルボニルの混合基（互いに反転）である。^[要出典]

ヌクレオチドが 4 つしかない正確な理由は議論されていますが、使用されていない可能性がいくつかあります。さらに、アデニンは塩基対形成に最も安定した選択肢ではありません。シアノファージ S-2L では、アデニンの代わりにジアミノプリン(DAP) が使用されています。 ^[26]ジアミノプリンは、アデニンと同一ですが、位置 2 にアミン基があり、3 つの分子内水素結合を形成するため、チミンと完全に塩基対を形成し、2 種類の塩基対 (弱い AT と強い CG) の主な違いを排除します。この安定性の向上は、これらの違いに依存するタンパク質結合相互作用に影響します。他の組み合わせには次のものがあります。

• イソグアニンとイソシトシンは、標準的なグアニンとシトシンと比較してアミンとケトンが反転しています。互変異性体は塩基対形成に問題があるため、使用されていませんが、イソCとイソGは4つの標準塩基が存在してもPCRで正しく増幅できます。^[27]
• ジアミノピリミジンとキサンチンは、2-アミノアデニンとチミンのように結合しますが、構造が反転しています。キサンチンは脱アミノ化生成物であるため、このペアは使用されません。

しかし、塩基が水素結合で対になっていなくても正しいDNA構造が形成される可能性がある。つまり、DNAアイソスター（原子数が同じ類似体）であるチミン類似体2,4-ジフルオロトルエン（F）やアデニン類似体4-メチルベンズイミダゾール（Z）で研究が示しているように、塩基は疎水性によって対になる。^[28]代わりの疎水性ペアとしては、イソキノリンとピロロ[2,3-b]ピリジンが考えられる^[29]

その他の注目すべき塩基対:

• 2-アミノ-6-(2-チエニル)プリンとピロール-2-カルボアルデヒド塩基対など、いくつかの蛍光塩基も作られている。^[30]
• 金属配位塩基、例えばピリジン-2,6-ジカルボキシレート（三座配位子）とピリジン（一座配位子）が中心の銅イオンに平面四角配位して対を形成するもの。^[31]
• ユニバーサル塩基は、他の塩基と無差別にペアになることがあります。しかし、一般的には、配列の融解温度をかなり下げます。例としては、2'-デオキシイノシン（ヒポキサンチンデオキシヌクレオチド）誘導体、ニトロアゾール類似体、疎水性芳香族非水素結合塩基（強いスタッキング効果）などがあります。これらは概念実証として使用され、一般的には縮重プライマー（プライマーの混合物）では使用されません。
• xDNAを考慮すると、可能な塩基対の数は2倍になります。xDNAには、ベンゼン環が追加された拡張塩基が含まれており、これが標準塩基と対になる可能性があり、その結果、8つの塩基（未使用の配置が使用される場合は16塩基）で4つの追加の可能な塩基対（xA-T、xT-A、xC-G、xG-C）が生成されます。ベンゼンが追加された塩基の別の形式はyDNAであり、ベンゼンによって塩基が拡張されます。^[32]

金属塩基対形成では、ワトソン・クリック型の水素結合は、金属イオンとリガンドとして働くヌクレオシドとの相互作用に置き換えられる。中心金属原子の周りに2つの二座ヌクレオシドが二重鎖を形成する金属の形状は、四面体、十二面体、および平面四角形である。金属とDNAの錯形成は、金属イオンの関与による天然核酸塩基からの非標準的な塩基対の形成、およびワトソン・クリック型塩基対形成の一部である水素原子を金属イオンで交換することによって起こり得る。^[33]金属イオンをDNA二重鎖に導入すると、潜在的な磁性^[34]または伝導性^[35]および安定性の向上が見られることが示されている。^[36]

金属錯体形成は天然核酸塩基間で起こることが示されている。よく文書化された例はT-Hg-Tの形成であり、これは2つの脱プロトン化されたチミン核酸塩基がHg ²⁺によって一緒になり、連結した金属塩基対を形成する。^[37]このモチーフは、二重鎖形成よりも好ましい鎖内ヘアピン形成プロセスのため、二重鎖内に積み重ねられたHg ^{2+を収容しない。 [38]}互いに向かい合った2つのチミンは二重鎖内でワトソン-クリック塩基対を形成しない。これは、ワトソン-クリック塩基対の不一致が金属塩基対の形成によって安定化される例である。天然核酸塩基への金属錯体形成の別の例は、高pHでのA-Zn-TおよびG-Zn-Cの形成である。Co ²⁺およびNi ²⁺もこれらの錯体を形成する。これらはワトソン・クリック塩基対であり、二価カチオンが核酸塩基に配位結合している。正確な結合については議論がある。^[39]

金属塩基対として使用するために、多種多様な人工核酸塩基が開発されている。これらの修飾核酸塩基は、特定の金属に最適化できる調整可能な電子特性、サイズ、結合親和性を示す。例えば、ピリジン-2,6-ジカルボキシレートで修飾されたヌクレオシドは Cu ²⁺に強く結合するのに対し、他の二価イオンは緩くしか結合しないことが示されている。三座配位特性がこの選択性に寄与している。銅上の4番目の配位部位は、反対に配置されたピリジン核酸塩基によって飽和されている。^[40]非対称金属塩基対形成システムは、ワトソン-クリック塩基対と直交している。人工核酸塩基の別の例としては、 DNA二重鎖内でCu ²⁺と結合できるヒドロキシピリドン核酸塩基が挙げられる。 5つの連続した銅-ヒドロキシピリドン塩基対が二重鎖に組み込まれ、その両端には1つの天然核酸塩基のみが隣接していた。EPRデータによると、銅中心間の距離は3.7±0.1Åと推定されたが、天然のB型DNA二重鎖はわずかに大きい（3.4Å）だけであった。^[41] DNA二重鎖内に金属イオンを積み重ねることの魅力は、ナノスケールの自己組織化金属ワイヤを得られるという期待であるが、これはまだ実現されていない。

人工塩基対（UBP）は、研究室で作られ、自然界には存在しない、設計されたDNAのサブユニット（または核酸塩基）です。2012年、カリフォルニア州サンディエゴのスクリプス研究所の化学生物学者であるフロイド・ロムスバーグ率いるアメリカの科学者グループは、彼のチームがd5SICSとdNaMという名前の2つの人工塩基対を設計したことを発表しました。^{[42]より技術的には、疎水性核酸}塩基を持つこれらの人工ヌクレオチドは、 DNA内でd5SICS-dNaM複合体または塩基対を形成する2つの融合した芳香環を特徴としています。 ^{[10] [43]} 2014年に、同じチームは、天然のTA塩基対とCG塩基対に加えて、ロムスバーグの研究室が設計し、一般的な細菌である大腸菌の細胞に挿入した最も優れた性能のUBPを含むプラスミドを合成したと報告しました。^[44]これは、生物が拡張された遺伝暗号を次の世代に伝える最初の例です。^{[10] [45]これは、d5SICSTPとdNaMTPの両方の三リン酸を}大腸菌に効率的に輸入するヌクレオチド三リン酸トランスポーターを発現する藻類の補助遺伝子を追加することで部分的に達成されました。^{[10]その後、天然の細菌複製経路はそれらを使用して、d5SICS-dNaMを含む}プラスミドを正確に複製します。^[要出典]

3つ目の塩基対の組み込みに成功したことは、DNAでコードできるアミノ酸の数を現在の20種類から理論的には172種類まで大幅に増やすという目標に向けた大きな進歩であり、それによって生物が新しいタンパク質を生産する可能性が広がる。^[44]これまで、人工のDNA鎖は何もコードしていなかったが、科学者は、産業用または製薬用の新しいタンパク質を製造するように設計できるのではないかと推測していた。^[46]非天然の塩基​​対を含むDNAの転写と対応するmRNAの翻訳は、実は最近達成された。2017年11月、細菌DNAに2つの余分な核酸塩基を初めて導入したスクリプス研究所の同じチームが、そのようなDNAを使用してタンパク質を生成できる半合成大腸菌を構築したと報告した。そのDNAには、6つの異なる核酸塩基が含まれていた。4つは標準的なもので、2つは人工的に追加されたdNaMとdTPT3（この2つはペアを形成）である。細菌には2つの新しいコドンに含まれる2つの対応するRNA塩基、これらの新しいコドンを認識する追加のtRNA（これらのtRNAにはアンチコドン内に2つの新しいRNA塩基も含まれていた）、および追加のアミノ酸があり、細菌は「非天然」タンパク質を合成することができた。^{[47] [48]}

UBPのもう一つの実証は、日本の理化学研究所の平尾一郎のグループによって達成されました。2002年に、彼らは2-アミノ-8-(2-チエニル)プリン(s)とピリジン-2-オン(y)の間の非天然塩基対を開発しました。これは、 in vitroでの転写と翻訳において機能し、非標準アミノ酸をタンパク質に部位特異的に組み込むことができます。^[49] 2006年には、彼らは7-(2-チエニル)イミダゾ[4,5-b]ピリジン(Ds)とピロール-2-カルボアルデヒド(Pa)を、複製と転写のための3番目の塩基対として作成しました。^[50]その後、Dsと4-[3-(6-アミノヘキサナミド)-1-プロピニル]-2-ニトロピロール(Px)がPCR増幅における高忠実度ペアとして発見されました。^{[51] [52]} 2013年に、彼らはDs-Pxペアをin vitro選択によるDNAアプタマー生成（SELEX）に適用し、遺伝子アルファベットの拡張が標的タンパク質に対するDNAアプタマーの親和性を大幅に増強することを実証した。^[53]

細胞遺伝物質から独立した直交システムを細胞内に実装し、完全に安全なシステムを構築する可能性が理論的にも実験的にも提案され研究されてきた。 ^[54 ]エンコード能力の向上も期待できる^[55 ]。 いくつかのグループがさまざまな側面に焦点を当てている。

• 上記で説明した新しいバックボーンと塩基対。
• XNA人工複製および転写ポリメラーゼは一般にT7 RNAポリメラーゼから始まる。^[56]
• （16Sリボソーム配列に改変された抗シャイン・ダルガノ配列を導入し、それと一致する改変シャイン・ダルガノ配列を持つ直交mRNAのみの翻訳を可能にする；^[57]および
• 拡張された遺伝コードのための非天然アミノ酸をコードする新規 tRNA 。