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アミノアリルヌクレオチドは、アリルアミンを含む修飾塩基を持つヌクレオチドです。これらは、マイクロアレイでの蛍光検出による核酸のポストラベリングに使用されます。これらは、蛍光染料をヌクレオチドの第一級アミノ基に結合するのに役立つN-ヒドロキシスクシンイミドエステル基と反応します。これらのヌクレオチドは、アミノアリル基が通常、ウラシルまたはシトシンのピリミジン環の炭素 5 に結合するため、5-(3-アミノアリル)-ヌクレオチドとして知られています。アミノアリル部分の第一級アミン基は脂肪族であるため、塩基の環 (芳香族) に直接結合しているアミン基と比較して反応性が高くなります。アミノアリルヌクレオシドの一般名は、アミノアリルを示すために、最初は aa- または AA- と略されます。5 炭素糖は、デオキシリボース(含まれている場合) またはリボース (含まれていない場合) を示す小文字の「d」の有無で示されます。最後に窒素塩基とリン酸の数が示されます（つまり、aa-UTP = アミノアリルウリジン三リン酸）。
歴史
蛍光と核酸を組み合わせる目的は、DNAやRNAの研究に検出可能な非同位体タグを提供することです。このタイプの標識により、科学者はDNAやRNAの構造、機能、または他の核酸との形成を研究できます。[2]蛍光標識の最初の塩基修飾は、1971年に4-チオウリジンと4-チオウラシルで行われました。[3]この研究と、類似体、酵素による付加、またはその他の方法によるさまざまな種類の直接的および非直接的な標識を含む他の研究により、科学者がDNAを研究するためのヌクレオチドの標識がはるかに安全になりました。[2]
DNAマイクロアレイの分野では機器や技術が進歩するにつれて、科学的研究を進めるためにはより優れた試薬や技術が必要になる。Cy3による蛍光標識は不十分で結果を歪めることが示されたため、代わりにアミノアリルヌクレオチドを組み込む方法が選択された。アミノアリルヌクレオチドを間接蛍光標識として使用すると、シアニン標識で見られる感度の問題が解消されると思われる。[4]
合成
アミノアリルヌクレオシドは、下の図に示すようにヘックカップリングによって合成することができます。 [5]
上の画像の左側は、ピリミジン環の5番目の炭素にヨウ素（求電子ハロゲン化によってヨウ素が付加される）が付加された修飾ヌクレオシドである。その形成はアリルアミンとの反応と関連しており、ヘックカップリングを介した様々な試薬は、塩基からハロゲン基を除去し、アリルアミンを付加して、右側に示すアミノアリルヌクレオシドになることができる。 [5]右側の生成物は、その後、分子生物学のRNA合成に使用される。[4] [6] [7]
他の反応としては、他のハロゲンとのワンポット合成が挙げられる。[8]
反応
アミノアリルヌクレオチド上の第一級アミンは、シアニンなどのアミノ反応性染料[9]や、スクシンイミジルエステル（ NHS ）などの反応性脱離基を含む特許染料[10] [11]と反応する。塩基の環に直接結合したアミン基は影響を受けない。これらのヌクレオチドはDNAの標識に使用される。[4] [6] [10] [11] [12]
用途
アミノアリルNTPは、PCR、ニックトランスレーション、プライマー伸長、cDNA合成における間接DNA標識に使用されます。 [13]これらの標識NTPは、放射性物質を取り扱う能力がない分子生物学研究室での使用に便利です。たとえば、5-(3-アミノアリル)-ウリジン(AA-UTP)は、DNAを事前に標識するよりもDNAの高密度標識に効果的です。NTPを酵素で添加した後、アミン反応性蛍光色素を添加してDNA分子を検出できます。[7] DNA/RNAポリメラーゼによってDNAまたはRNA分子に組み込まれると、5-(3-アミノアリル)-UTPは他の化学基を添加するための反応基を提供します。したがって、アミノアリル修飾DNAまたはRNAは、アミン反応基を持つ任意の化合物で標識できます。二次色素カップリング試薬と組み合わせてDNA/RNAに組み込まれたaa-NTPは、アレイ分析のプローブになります。[6]
cDNAは検出目的でアミノアリル標識に依存しています。dNTPの直接標識は蛍光標識の最も迅速で安価な方法ですが、配列が使用できる修飾ヌクレオチドが1つだけであるという欠点があります。直接標識のもう1つの欠点はかさばるヌクレオチドですが、これはアミノアリル修飾ヌクレオチドを使用した間接標識によって克服できます。[14]標識の成功を確認する簡単な方法は色です。良好な標識は、最終材料で目に見える青（Cy5）または赤（Cy3）の色をもたらします。[15]
アミノアリル標識を使用する別のプロセスは、RNAを増幅するための高感度技術であるNASBA（核酸配列に基づく増幅）です。この特定のケースでは、aaUTP修飾RNAに蛍光マーカーCy3がタグ付けされました。アミノアリルUTP標識と組み合わせたNASBAは、環境モニタリング、生物学的脅威検出、産業プロセスモニタリング、臨床微生物学など、微生物診断のさまざまな分野で非常に役立ちます。[16] DNAマイクロアレイは、AA-NTPを特に利用してDNAマイクロアレイテストをより迅速かつ安価にする別の方法です。[12]
合成後の標識は、同等の標識効果を持つプローブを生成することで、Cy標識dNTPの直接酵素組み込みで見られる問題を回避します。間接標識では、アミン修飾NTPは逆転写、RNA増幅、またはPCR中に組み込まれます。アミノアリルNTPは、重合中に非修飾NTPと同様の効率で組み込まれます。[17] [18]
標識に関する懸念: アミノアリル修飾ヌクレオチドのアミン基は、シアニン系列の染料や他の特許取得済み染料と反応します。染料がヌクレオチドの適切な保存に必要な緩衝剤と反応すると問題が発生します。しかし、炭酸緩衝液を使用することでこの問題を克服できます。[19]
参照
参考文献
- ^ Hogan, Daniel J.; Riordan, Daniel P.; Gerber, André P.; Herschlag, Daniel; Brown, Patrick O. (2008). 「多様なRNA結合タンパク質が機能的に関連するRNAセットと相互作用し、広範な調節システムを示唆」PLOS Biology . 6 (10): e255. doi : 10.1371/journal.pbio.0060255 . PMC 2573929 . PMID 18959479.
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外部リンク
- Holly BennetとJoe DeRisiによるサンプルプロトコルはRosetta Informaticsで作成され、Chris Seidelによって修正されました。[1]
- ^ Seidel, Chris. 「蛍光プローブの準備」 。 2014年3月24日閲覧。