安定した核酸脂質粒子

安定核酸脂質粒子（SNALP ）は、直径約120ナノメートルの微小粒子で、可視光の波長よりも小さい。これらは、哺乳類にsiRNAを治療的に送達するために生体内で使用されている。SNALPでは、siRNAは、拡散性ポリエチレングリコールでコーティングされたカチオン性脂質と融合性脂質の混合物を含む脂質二重層に囲まれている。^[1]

RNA干渉（RNAi）は、細胞質内で自然に発生するプロセスであり、特定の配列での遺伝子発現を阻害します。RNAiによる遺伝子発現の調節は、標的遺伝子の発現を効果的に抑制する低分子干渉RNA （siRNA）を導入することで可能になります。RNAiは、切断されたdsRNAから派生したsiRNAを含むRNA誘導サイレンシング複合体（RISC）を活性化します。siRNAは、RISCによって切断されたmRNA上の特定の配列にRISC複合体を誘導し、その結果、それらの遺伝子をサイレンシングします。^[2]

しかし、RNA骨格の改変や両端の塩基の反転の包含がなければ、siRNAは血漿中で不安定であるため、この技術を生体内に適用することは極めて困難である。 パターン認識受容体（PRR）は、エンドサイトーシスPRRまたはシグナル伝達PRRとして分類することができ、自然免疫系のすべての細胞で発現している。シグナル伝達PRRには特に、Toll様受容体（TLR）が含まれ、主に病原体関連分子パターン（PAMP）の特定に関与している。例えば、TLRはさまざまな病原体で保存されている特定の領域を認識することができ、その認識は免疫応答を刺激し、生物に壊滅的な影響を及ぼす可能性がある。特に、TLR 3は、ウイルス複製に特徴的なdsRNAと、同じく二本鎖であるsiRNAの両方を認識します。 ^[3]この不安定性に加えて、siRNA療法のもう1つの制限は、特定の組織を標的にすることができないことです。

しかし、SNALPは、このRNAi療法の効果に必要な安定性と特異性を提供できる可能性がある。脂質二重層からなるSNALPは、siRNAを分解する血漿内のヌクレアーゼからsiRNAを保護することで、siRNAに安定性を与えることができる。さらに、siRNAの送達はエンドソーム輸送の影響を受けやすく、 TLR3およびTLR7にさらされる可能性があり、インターフェロンおよび炎症性サイトカインの活性化につながる可能性がある。しかし、SNALPは、 Toll様受容体を活性化せずにsiRNAをエンドソームに取り込むことを可能にし、その結果、阻害的な免疫応答を刺激し、siRNAがエンドソームから脱出することを可能にする。^[1]

siRNA による遺伝子発現のダウンレギュレーションは、 in vitro研究における重要な研究ツールとなっています。しかし、siRNA はヌクレアーゼによる分解を受けやすいため、in vivoでの使用には問題があります。2005 年に、げっ歯類のB 型肝炎ウイルス(HBV) を研究している研究者は、siRNA の特定の修飾により、血漿内のヌクレアーゼによる分解が防止され、未修飾の siRNA に比べて遺伝子サイレンシングが増加することを突き止めました。センス鎖とアンチセンス鎖への修飾は、別々に行われました。センス鎖とアンチセンス鎖の両方において、すべてのピリミジン位置で 2'-OH が 2'-フルオロに置換されました。さらに、センス鎖はすべてのプリン位置でデオキシリボースに修飾され、アンチセンス鎖は同じ位置で2'- O -メチルに修飾されました。センス鎖の5'末端と3'末端は非塩基逆位反復配列でキャップされ、アンチセンス鎖の3'末端にはホスホロチオエート結合が組み込まれていた。 ^[4]

この研究は、修飾 siRNA を使用した潜在的な RNAi 療法を実証しましたが、げっ歯類における HBV DNA の 90% の減少は、30 mg/kg の用量を頻繁に投与した結果でした。これは実行可能な投与計画ではないため、この同じグループは、siRNA をPEG 化脂質二重層 (SNALP) にカプセル化した場合の効果を調べました。具体的には、脂質二重層は細胞への取り込みとそれに続くエンドソームからの放出を促進し、PEG 化された外層は、結果として生じる外部の親水性により、製剤化中に安定性を提供します。この 2005 年の研究によると、研究者は 3 日間 3 mg/kg/日の用量の siRNA を投与することで HBV DNA を 90% 減少させましたが、これは以前の研究よりも大幅に低い用量です。さらに、修飾されていない、または修飾されてカプセル化されていないsiRNAとは対照的に、SNALP送達siRNAの投与では、IFN-αなどのインターフェロンや免疫刺激に関連する炎症性サイトカインが検出可能なレベルにまで減少しました。それでも、研究者は、実行可能な投与量と投与計画に到達するためにはさらなる研究が必要であることを認めました。^[5]

2006年、非ヒト霊長類におけるアポリポタンパク質B （ApoB）のサイレンシングに取り組んでいる研究者らは、SNALPで送達されたAPOB特異的siRNAの2.5mg/kgの単回投与で90%のサイレンシングを達成した。ApoBは、超低密度リポタンパク質（VLDL）および低密度リポタンパク質（LDL）の組み立てと分泌に関与するタンパク質であり、主に肝臓と小腸で発現している。VLDLとLDLは両方ともコレステロールの輸送とその代謝に重要である。この程度のサイレンシングは投与後約24時間で非常に迅速に観察されただけでなく、サイレンシング効果は単回投与後22日間以上維持された。研究者らは1mg/kgの単回投与も試験し、標的遺伝子の68%のサイレンシングを得て、用量依存的なサイレンシングを示した。この用量依存的なサイレンシングは、サイレンシングの程度だけでなく、サイレンシングの持続時間にも顕著に表れており、標的遺伝子の発現は投与後72時間で回復した。^[6]

直径 100 nm の SNALP は、特定の遺伝子を標的にしてサイレンシングするのに効果的に使用されていますが、サイズに特に関係するさまざまな全身的障壁があります。たとえば、固形腫瘍への拡散は大きな SNALP によって妨げられ、同様に、炎症細胞は浸透と保持が強化されているため、大きな SNALP が侵入しにくくなります。さらに、網内系による除去、血液脳関門のサイズ選択性、毛細血管窓の制限などにより、標的特異的 siRNA を効果的に送達するには、より小さな SNALP が必要になります。2012 年、ドイツの科学者は、50% イソプロパノール溶液の段階的希釈を伴う非常に単純な溶媒交換法を使用して、「モノ NALP」と呼ばれるものを開発しました。その結果、従来の SNALP に似た非常に安定した送達システムが生まれましたが、直径はわずか 30 nm でした。ここで開発されたモノNALPは不活性であるが、同様の送達システムで使用される特定の標的化および放出メカニズムを実装することで活性キャリアになることができる。^[7]

相対的な効力に応じて、SNALP に封入された siRNA のプールまたは個々の SNALP siRNA のいずれかで完全な防御を与えることができました... [最も効力のある siRNA] ... は絶対的な防御、つまり 100 パーセントの生存率を与え、感染したモルモットの完全な無ウイルス血症にも貢献しました。そのため、動物にウイルスの致死感染量の 30,000 倍の量を接種したにもかかわらず、エボラウイルスは検出されませんでした。

—  Thomas Geisbert、USAMRIID、2006 年 5 月^[8]

2010 年 5 月、SNALP をエボラザイール ウイルスに適用したというニュースが話題になりました。アフリカで散発的に発生したこのウイルスは、ヒトの致死率が最大 90% に達することもあります。アカゲザルに投与したこの製剤は、致死量のウイルスにさらされた直後に投与したところ、治癒することができたからです。アカゲザルに使用された治療薬は、3 つのウイルス遺伝子を標的とする 3 つの siRNA (RNA の交互に並んだ二重鎖) で構成されていました。SNALP (ここではサイズが約 81 nm) は、コレステロール、ジパルミトイルホスファチジルコリン 、 3-N-[(ω-メトキシポリ (エチレングリコール) 2000) カルバモイル]-1,2-ジミレスチルオキシプロピルアミン、およびカチオン性 1,2-ジリノレイルオキシ-3-N,N-ジメチルアミノプロパンの混合物から自発的な小胞形成によって配合されました。^[9]

アカゲザルへの適用に加えて、SNALP は、 ZEBOV への曝露後すぐに投与された場合、モルモットをウイルス血症および死亡から保護することも証明されています。ポリメラーゼ (L) 遺伝子特異的 siRNA 送達システムは、EBOV 粒子内にあるリボ核タンパク質複合体のウイルスゲノム RNA に関連する 4 つの遺伝子 (そのうち 3 つは上記の適用に一致) に課されました: NP、VP30、VP35、および L タンパク質。SNALP のサイズは 71 - 84 nm で、合成コレステロール、リン脂質 DSPC、PEG 脂質 PEGC-DMA、およびカチオン脂質 DLinDMA で構成され、モル比は 48:20:2:30 でした。^[10] この結果は、エボラウイルスの診断後にSNALP-siRNA送達システムを投与した場合、モルモットのウイルス血症と死亡に対する完全な保護を確認し、この技術が効果的な治療法であることを証明しました。今後の研究では、主にEBOV遺伝子に対するsiRNA「カクテル」の効果を評価して抗ウイルス効果を高めることに焦点を当てます。^[10]

2010 年、研究者らはヒトの肝細胞癌(HCC) に適用可能な標的療法を開発しました。早期 HCC で発見された COP9 シグナロソーム複合体の 5 番目のサブユニットである CSN5 の同定は、siRNA 誘導の治療標的として使用されました。SNALP に封入された改変 CSN5siRNA の全身投与は、ヒト肝癌の Huh7-luc+ 同所性異種移植モデルにおける肝腫瘍の成長を著しく抑制しました。siRNA による CSN5 ノックダウンは、in vitro で HCC 細胞の細胞周期の進行を抑制し、アポトーシスの速度を上昇させることも証明されました。これらの結果は、肝癌の進行における CSN5 の役割を実証するだけでなく、CSN5 が HCC の病因に不可欠な役割を果たしていることも示しています。結論として、SNALP は治療的サイレンシングを通じてヒト Huh7-luc* 細胞における肝細胞癌の腫瘍の成長を著しく減少させることが証明されました。^[11]

2009年、研究者らはポロ様キナーゼ1（PLK1）とキネシンスピンドルタンパク質（KSP）の両方を標的とするsiRNAを開発しました。両タンパク質は腫瘍細胞の細胞周期に重要であり、PLK1はさまざまなタンパク質のリン酸化に関与し、KSPは有糸分裂中の染色体分離に不可欠です。具体的には、KSPが阻害されると双極性有糸分裂紡錘体が形成できず、細胞周期が停止し、最終的にはアポトーシスにつながります。同様に、PLK1の阻害は有糸分裂停止と細胞アポトーシスを促進します。研究によると、腫瘍を移植したマウスに3週間にわたり2mg/kgのPLK1特異的siRNAを投与したところ、生存期間が延長し、腫瘍が明らかに減少しました。実際、治療を受けたマウスの平均生存期間は51日であったのに対し、対照群では32日でした。さらに、治療を受けた6匹のマウスのうち、移植部位の周囲に目立った腫瘍があったのは2匹だけでした。それでも、腫瘍由来のシグナルであるGAPDHは低レベルで存在し、腫瘍の成長は大幅に抑制されたものの、完全に除去されたわけではないことを示しています。それでも、結果は毒性が最小限であり、骨髄の重大な機能障害がないことを示唆しています。KSP特異的siRNAで治療された動物も、対照群の20日間と比較して、生存期間が28日間に延長しました。^[12]