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選択的スプライシング、または選択的RNAスプライシング、あるいは差動スプライシングは、遺伝子発現中に起こる選択的スプライシングのプロセスであり、単一の遺伝子から異なるスプライスバリアントを生成することを可能にする。例えば、遺伝子のいくつかのエクソンは、遺伝子の最終的なRNA産物に含まれるか、またはそこから除外される。 [1]これは、エクソンが異なる組み合わせで結合され、異なるスプライスバリアントが生じることを意味する。タンパク質コード遺伝子の場合、これらのスプライスバリアントから翻訳されたタンパク質は、アミノ酸配列や生物学的機能に違いがある可能性がある（図を参照）。
生物学的に重要な選択的スプライシングは真核生物の正常な現象として起こり、ゲノムでコード化できるタンパク質の数を増加させます。[1]ヒトでは、マルチエクソン遺伝子の約95％が選択的スプライシングによって同じ遺伝子から機能的な代替産物が生成されると考えられていますが、多くの科学者は、観察されるスプライスバリアントのほとんどがスプライシングエラーによるものであり、生物学的に重要な選択的スプライシング遺伝子の実際の数ははるかに少ないと考えています。[3] [4 ]
発見
選択的スプライシングは 1977 年に初めて観察されました。[5] [6]アデノウイルスは、感染サイクルの初期、つまりウイルス DNA 複製前に 5 つの一次転写産物を生成し、その後 DNA 複製開始後にさらに 1 つ生成します。初期の一次転写産物は DNA 複製開始後も生成され続けます。感染後期に生成される追加の一次転写産物は大きく、32kb のアデノウイルスゲノムの 5/6 に由来します。これは、感染細胞に存在する個々のアデノウイルス mRNA のどれよりもはるかに大きいものです。研究者らは、後期にアデノウイルス 2 型によって生成された一次 RNA 転写産物がさまざまな方法でスプライシングされ、異なるウイルスタンパク質をコードする mRNA が生成されることを発見しました。さらに、一次転写産物には複数のポリアデニル化部位が含まれており、処理された mRNA の 3' 末端が異なります。[7] [8] [9]
1981年、正常な内因性遺伝子からの転写産物における選択的スプライシングの最初の例が特徴づけられました。[7]甲状腺ホルモンカルシトニンをコードする遺伝子は、哺乳類細胞で選択的スプライシングされることがわかりました。この遺伝子からの一次転写産物には6つのエクソンが含まれます。カルシトニンmRNAはエクソン1〜4を含み、エクソン4のポリアデニル化部位の後で終了します。別のmRNAは、エクソン4をスキップしてこのプレmRNAから生成され、エクソン1〜3、5、および6を含みます。これは、CGRP（カルシトニン遺伝子関連ペプチド）と呼ばれるタンパク質をコードします。[10] [11]哺乳類の免疫グロブリン遺伝子転写産物における選択的スプライシングの例も、1980年代初頭に観察されました。[7] [12]
それ以来、真核生物において生物学的に重要な選択的スプライシングの多くの例が発見されている。[1]選択的スプライシングの「記録保持者」は、Dscamと呼ばれるD. melanogaster遺伝子であり、潜在的に38,016のスプライスバリアントが存在する可能性がある。[13]
2021年、選択的スプライシングが初めて特定されたアデノウイルスであるアデノウイルス2型のゲノムは、これまで考えられていたよりもはるかに多様なスプライスバリアントを生成できることが発見されました。[14]次世代シーケンシング技術を使用することで、研究者はヒトアデノウイルス2型のトランスクリプトームを更新し、複雑な選択的スプライシングパターンを通じてウイルスによって生成された904のスプライスバリアントの存在を記録することができました。これらのスプライスバリアントのうち機能することが示されたものはごくわずかであり、著者らは論文の中でこの点を指摘しています。
- 「未解決の疑問は、この新しいRNAの集合体がどのような役割を果たしているのか、あるいは、それらは過剰なスプライシング機構によって生成された偽の分子なのかということである。」[14]
モード
選択的スプライシングには一般的に5つの基本的なモードが認識されている。[1] [2] [16] [15]
- エクソンスキッピングまたはカセットエクソン：この場合、エクソンは一次転写産物から除去されるか、保持される。これは哺乳類のpre-mRNAで最も一般的なモードである。[15]
- 相互に排他的なエクソン: スプライシング後、2 つのエクソンのうち 1 つが mRNA に保持されますが、両方が保持されるわけではありません。
- 代替ドナー サイト: 代替の 5' スプライス ジャンクション (ドナー サイト) が使用され、上流エクソンの 3' 境界が変更されます。
- 代替アクセプター サイト: 代替の 3' スプライス ジャンクション (アクセプター サイト) が使用され、下流のエクソンの 5' 境界が変更されます。
- イントロン保持: 配列はイントロンとして切り取られるか、または単に保持される。保持された配列はイントロンに挟まれていないため、これはエクソンスキッピングとは区別される。保持されたイントロンがコード領域にある場合、イントロンは隣接するエクソンとインフレームでアミノ酸をコードしなければならない。そうでない場合、ストップコドンまたはリーディングフレームのシフトによりタンパク質は機能しなくなる。これは哺乳類では最もまれなモードだが、植物では最も一般的なモードである。[15] [17]
これらの主な選択的スプライシングのモードに加えて、同じ遺伝子から異なる mRNA が生成される主なメカニズムが 2 つあります。複数のプロモーターと複数のポリアデニル化部位です。複数のプロモーターの使用は、選択的スプライシングではなく転写制御メカニズムとして適切に説明されます。異なるポイントで転写を開始することで、5' 末端の異なるエクソンを持つ転写産物が生成されます。もう一方では、複数のポリアデニル化部位が転写産物の異なる 3' 末端を提供します。これらのメカニズムは両方とも選択的スプライシングと組み合わせて見られ、遺伝子から派生した mRNA にさらなる多様性をもたらします。[1] [16]
これらのモードは基本的なスプライシング機構を説明していますが、複雑なスプライシングイベントを説明するには不十分な場合があります。たとえば、右の図は、マウスヒアルロニダーゼ3遺伝子の3つのスプライスフォームを示しています。最初の行（緑）のエクソン構造と2番目の行（黄色）のエクソン構造を比較すると、イントロン保持が示されますが、2番目と3番目のスプライスフォーム（黄色と青）の比較では、エクソンスキップが示されています。すべての可能なスプライシングパターンを一意に指定するモデル命名法が最近提案されました。[15]
メカニズム
一般的なスプライシングメカニズム
DNAから転写された pre-mRNA には、複数のイントロンとエクソンが含まれます(線虫では、平均 4～5 個のエクソンとイントロンです。ショウジョウバエのショウジョウバエでは、1 つの転写された pre-mRNA に 100 個以上のイントロンとエクソンが含まれることがあります)。mRNA に保持されるエクソンは、スプライシングの過程で決定されます。スプライス サイトの制御と選択は、トランス作用性スプライシング アクティベーターとスプライシング リプレッサー タンパク質、および exonic スプライシング エンハンサーや exonic スプライシング サイレンサーなど pre-mRNA 自体の内部にあるシス作用性要素によって行われます。
典型的な真核生物の核イントロンには、重要な領域を定義するコンセンサス配列がある。各イントロンの 5' 末端には GU 配列がある。3' 末端の近くには分岐部位がある。分岐点のヌクレオチドは常に A であるが、この配列の周りのコンセンサスは多少変化する。ヒトでは、分岐部位のコンセンサス配列は yUnAy である。[18]分岐部位の後には一連のピリミジン（ポリピリミジン領域）が続き、3' 末端には AG が続く。[16]
mRNAのスプライシングは、スプライソソームと呼ばれるRNAとタンパク質の複合体によって行われ、U1、U2、U4、U5、U6と呼ばれるsnRNPが含まれています（U3はmRNAのスプライシングには関与しません）。 [19] U1は5'GUに結合し、U2はU2AFタンパク質因子の助けを借りて、分岐部位内の分岐点Aに結合します。この段階の複合体は、スプライソソームA複合体として知られています。A複合体の形成は通常、スプライシングされるイントロンの末端を決定し、保持されるエクソンの末端を定義する上で重要なステップです。[16]（Uという命名は、ウリジン含有量が多いことに由来しています）。
U4、U5、U6 複合体が結合し、U6 が U1 の位置を置換します。U1 と U4 は離れます。残った複合体は、2 つのエステル交換反応を実行します。最初のエステル交換では、イントロンの 5' 末端が上流エクソンから切断され、2',5'-ホスホジエステル結合によって分岐部位 A に結合されます。2 番目のエステル交換では、イントロンの 3' 末端が下流エクソンから切断され、2 つのエクソンがホスホジエステル結合によって結合されます。その後、イントロンは投げ縄の形で放出され、分解されます。[1]
調節要素とタンパク質
スプライシングは、トランス作用タンパク質（リプレッサーとアクチベーター）と、プレmRNA上の対応するシス作用調節部位（サイレンサーとエンハンサー）によって制御されます。しかし、選択的スプライシングの複雑さの一部として、スプライシング因子の効果はしばしば位置に依存することが指摘されています。つまり、イントロンエンハンサー要素に結合するとスプライシングアクチベーターとして機能するスプライシング因子は、エクソンのコンテキストでそのスプライシング要素に結合するとリプレッサーとして機能する可能性があり、その逆も同様です。[20]プレmRNA転写物の二次構造も、スプライシング要素をまとめたり、スプライシング因子の結合要素として機能するはずの配列をマスクしたりするなど、スプライシングを制御する役割を果たします。[21] [22]これらの要素は一緒になって「スプライシングコード」を形成し、さまざまな細胞条件下でスプライシングがどのように発生するかを制御します。[23] [24]
pre-mRNAには2つの主要なタイプのシス作用RNA配列要素が存在し、それらには対応するトランス作用RNA結合タンパク質がある。スプライシングサイレンサーはスプライシングリプレッサータンパク質が結合する部位であり、近くの部位がスプライスジャンクションとして使用される可能性を低減する。これらはイントロン自体（イントロンスプライシングサイレンサー、ISS）または隣接するエクソン（エクソンスプライシングサイレンサー、ESS）に位置することができる。それらは配列が異なり、それらに結合するタンパク質の種類も異なる。スプライシングリプレッサーの大部分はhnRNPA1やポリピリミジントラクト結合タンパク質（PTB）などの異種核リボ核タンパク質（hnRNP）である。 [16] [23]スプライシングエンハンサーはスプライシングアクティベータータンパク質が結合する部位であり、近くの部位がスプライスジャンクションとして使用される可能性を高める。これらは、イントロン（イントロンスプライシングエンハンサー、ISE）またはエクソン（エクソンスプライシングエンハンサー、ESE）にも存在する可能性がある。ISEおよびESEに結合する活性化タンパク質のほとんどは、SRタンパク質ファミリーのメンバーである。このようなタンパク質には、RNA認識モチーフとアルギニンおよびセリンに富む（RS）ドメインが含まれている。[16] [23]
一般的に、スプライシングの決定因子はコンテキストに依存した相互依存的な方法で機能するため、スプライシングがどのように制御されるかを規定するルールはスプライシングコードを形成します。[24]特定のシス作用RNA配列要素の存在は、コンテキストに応じて、場合によっては近くのサイトがスプライシングされる確率を高めますが、他の場合には確率を低下させます。制御要素が機能するコンテキストには、他のRNA配列機能の存在によって確立されるシス作用コンテキストと、細胞の状態によって確立されるトランス作用コンテキストが含まれます。たとえば、一部のシス作用RNA配列要素は、コンテキストを確立するために複数の要素が同じ領域に存在する場合にのみスプライシングに影響します。別の例として、シス作用要素は、細胞内でどのタンパク質が発現しているか（たとえば、神経細胞と非神経細胞のPTB）に応じて、スプライシングに反対の効果をもたらす可能性があります。スプライシングサイレンサーとエンハンサーの適応的意義は、新しいサイレンサーを生成したり既存のエンハンサーを破壊する変異に対してヒト遺伝子に強い選択があることを示す研究によって証明されている。[25] [26]
例
エクソンスキッピング:ショウジョウバエ dsx
ショウジョウバエ遺伝子dsxのpre-mRNAには6つのエクソンが含まれています。雄ではエクソン1、2、3、5、6が結合してmRNAを形成し、雄の発達に必要な転写調節タンパク質をコードします。雌ではエクソン1、2、3、4が結合し、エクソン4のポリアデニル化シグナルがその時点でmRNAの切断を引き起こします。結果として生じるmRNAは雌の発達に必要な転写調節タンパク質です。[27]
これはエクソン スキッピングの例です。エクソン 4 の上流のイントロンには、コンセンサス配列とよく一致しないポリピリミジン トラクトがあるため、スプライシング アクティベーターの助けがなければ、U2AF タンパク質はそれにほとんど結合しません。この 3' スプライス アクセプター サイトは、したがって、オスでは使用されません。ただし、メスはスプライシング アクティベーター Transformer (Tra) を生成します (下記参照)。SR タンパク質 Tra2 は、男女ともに生成され、エクソン 4 の ESE に結合します。Tra が存在する場合、Tra2 に結合し、別の SR タンパク質とともに、U2AF タンパク質が弱いポリピリミジン トラクトに結合するのを助ける複合体を形成します。U2 は関連する分岐点にリクルートされ、これにより、mRNA にエクソン 4 が組み込まれます。[27] [28]
代替アクセプター部位:ショウジョウバエ トランス
キイロショウジョウバエのトランスフォーマー（Tra）遺伝子のプレmRNAは、選択的アクセプター部位モードを介して選択的スプライシングを受ける。遺伝子Traは、メスでのみ発現するタンパク質をコードしている。この遺伝子の一次転写産物には、2つの可能なアクセプター部位を持つイントロンが含まれている。オスでは、上流のアクセプター部位が使用される。これにより、早期の終止コドンを含む、エクソン2のより長いバージョンが処理された転写産物に含まれる。結果として生じるmRNAは、不活性な短縮されたタンパク質産物をコードしている。メスは、マスター性別決定タンパク質であるSex lethal（Sxl）を生成する。Sxlタンパク質は、上流アクセプター部位付近のTra転写産物のRNAにあるISSに結合するスプライシングリプレッサーであり、U2AFタンパク質がポリピリミジントラクトに結合するのを防ぐ。これにより、このジャンクションの使用が妨げられ、スプライソソームの結合が下流のアクセプター部位にシフトする。この時点でのスプライシングは、イントロンの一部として切除される終止コドンをバイパスします。結果として生じるmRNAは、それ自体が他の性関連遺伝子の選択的スプライシングの調節因子である活性Traタンパク質をコードします（上記のdsxを参照）。[1]
エクソンの定義: Fas 受容体
Fas受容体タンパク質の複数のアイソフォームは、選択的スプライシングによって生成される。ヒトで通常存在する2つのアイソフォームは、エクソンスキッピング機構によって生成される。エクソン6を含むmRNAは、アポトーシス、つまりプログラム細胞死を促進する膜結合型のFas受容体をコードしている。慢性的に日光にさらされた皮膚細胞ではFas受容体の発現が増加し、皮膚がん細胞では発現が見られないことから、この機構はヒトの前がん細胞の除去に重要である可能性が示唆される。[29]エクソン6がスキップされた場合、結果として生じるmRNAは、アポトーシスを促進しない可溶性Fasタンパク質をコードする。エクソンの包含またはスキップは、TIA-1とポリピリミジントラクト結合タンパク質（PTB）という2つの拮抗タンパク質に依存する。
- プレ mRNA のエクソン 6 の下流のイントロンの 5' ドナー サイトは、コンセンサス シーケンスとの一致が弱く、通常は U1 snRNP によって結合されません。U1 が結合しない場合は、エクソンがスキップされます (添付の図の「a」を参照)。
- TIA-1タンパク質がイントロンのスプライシングエンハンサー部位に結合すると、U1 snRNPの結合が安定化する。[16]結果として生じる5'ドナー部位複合体は、まだ知られていないメカニズムを介して、スプライシング因子U2AFがエクソンの上流の3'スプライス部位に結合するのを助ける（bを参照）。[30]
- エクソン 6 には、ピリミジンを豊富に含むエクソン スプライシング サイレンサーure6 が含まれており、ここに PTB が結合できます。PTB が結合すると、5' ドナー複合体が U2AF のアクセプター サイトへの結合に及ぼす影響が阻害され、エクソン スキッピングが発生します (c を参照)。
このメカニズムは、スプライシングにおけるエクソン定義の一例です。スプライソソームはイントロン上に組み立てられ、snRNPサブユニットはRNAを折り畳んでイントロンの5'末端と3'末端を結合します。しかし、最近研究されたこの例のように、エクソンの末端間にも相互作用があることが示されています。この特定のケースでは、これらのエクソン定義相互作用は、2つの隣接するイントロン上でスプライソソームを組み立てる前に、コアスプライシング因子の結合を可能にするために必要です。[30]
抑制因子と活性化因子の競合：HIV-1タトゥーエクソン2
ヒトにエイズを引き起こすレトロウイルスであるHIVは、単一の一次RNA転写産物を生成し、それが複数の方法で選択的スプライシングされて40種類を超えるmRNAを生成します。[31]差次的にスプライシングされた転写産物間の平衡により、ウイルスの増殖に必要な異なる産物をコードする複数のmRNAが得られます。[32]差次的にスプライシングされた転写産物の1つにはtat遺伝子が含まれており、そのエクソン2はスキップすることも含めることもできるカセットエクソンです。RNAへのtatエクソン2の組み込みは、スプライシングリプレッサーhnRNP A1とSRタンパク質SC35との競合によって制御されています。エクソン2内では、エクソンスプライシングサイレンサー配列（ESS）とエクソンスプライシングエンハンサー配列（ESE）が重複しています。 A1リプレッサータンパク質がESSに結合すると、複数のA1分子の協調的な結合が開始され、エクソン2の上流の5'ドナー部位にまで広がり、コアスプライシング因子U2AF35のポリピリミジントラクトへの結合が妨げられます。SC35がESEに結合すると、A1の結合が妨げられ、5'ドナー部位がスプライソソームの組み立てにアクセスできる状態に維持されます。アクチベーターとリプレッサーの競合により、両方のmRNAタイプ（エクソン2の有無にかかわらず）が生成されます。[31]
適応的意義
真の選択的スプライシングは、タンパク質コード遺伝子と非コード遺伝子の両方で発生し、複数の産物（タンパク質または非コードRNA）を生成します。DNA配列と最初の転写産物が与えられた場合、どの産物が生成されるかを決定するには外部情報が必要です。制御方法は継承されるため、突然変異が遺伝子発現に影響を与える新しい方法が提供されます。[33]
選択的スプライシングは進化の柔軟性をもたらす可能性がある。単一の点変異により、スプライシング中に特定のエクソンが転写産物から時折除外されたり含まれたりする可能性があり、元のタンパク質を失うことなく新しいタンパク質アイソフォームが生成される可能性があります。 [1]研究では、非構成的エクソンに豊富に含まれる本質的に無秩序な領域（本質的に非構造化タンパク質を参照）が特定されており[34]、タンパク質アイソフォームはこれらの領域内の機能モジュールの変更により機能的多様性を示す可能性があることを示唆しています。アイソフォームによって達成されるこのような機能的多様性は、その発現パターンに反映されており、機械学習アプローチによって予測できます。[35] [36]比較研究は、選択的スプライシングが進化において多細胞性に先行していることを示しており、このメカニズムが多細胞生物の発達を助けるために利用された可能性があることを示唆しています。[37]
ヒトゲノムプロジェクトやその他のゲノム配列に基づく研究によると、ヒトの遺伝子の数は線虫のCaenorhabditis elegansより約30%多く、ハエのDrosophila melanogasterの約2倍に過ぎない。この発見から、ヒト、あるいは脊椎動物全般のほうが複雑であると認識されているのは、ヒトの選択的スプライシングの率が無脊椎動物より高いためではないかという推測が生まれた。[38] [39]しかし、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ハエ（D. melanogaster）、線虫（C. elegans）、植物シロイヌナズナからそれぞれ10万個の発現配列タグ（EST）のサンプルを調べた研究では、ヒトとその他の試験対象動物の間で選択的スプライシング遺伝子の頻度に大きな違いは見られなかった。[40]しかし、別の研究では、これらの結果はさまざまな生物で利用可能なESTの数が異なるために生じたものであると提唱されている。各生物の遺伝子のランダムなサブセットにおける選択的スプライシング頻度を比較したところ、著者らは脊椎動物は無脊椎動物よりも選択的スプライシング率が高いという結論に達した。[41]
病気
RNA処理機構の変化は、複数の転写産物の誤ったスプライシングにつながる可能性がある一方で、スプライス部位またはシス作用スプライシング調節部位における一塩基の変化は、単一遺伝子のスプライシングに違いをもたらし、その結果、変異遺伝子の転写産物から生成されるmRNAに違いをもたらす可能性がある。確率分析を含む2005年の研究では、ヒトの疾患を引き起こす変異の60％以上が、コード配列に直接影響を与えるのではなく、スプライシングに影響を与えることが示された。[42]より最近の研究では、すべての遺伝性疾患の3分の1にスプライシングの要素がある可能性が高いことが示唆されている。[20]正確な割合に関わらず、スプライシングに関連する疾患は数多く存在する。[43]以下に説明するように、スプライシングに関連する疾患の顕著な例は癌である。
異常にスプライシングされたmRNAも、がん細胞の多くに見られます。[44] [45] [46] RNA-Seqとプロテオミクス解析を組み合わせた結果、重要ながん経路における主要なタンパク質のスプライスアイソフォームの顕著な差次的発現が明らかになりました。[47]このような異常なスプライシングパターンががんの成長に寄与しているのか、それともがんに関連する細胞異常の結果にすぎないのかは、必ずしも明らかではありません。大腸がんや前立腺がんなどの特定の種類のがんでは、がんごとのスプライシングエラーの数は個々のがん間で大きく異なることが示されており、この現象はトランスクリプトーム不安定性と呼ばれています。[48] [49]さらに、トランスクリプトーム不安定性は、スプライシング因子遺伝子の発現レベルの低下と大きく相関することが示されています。DNMT3Aの変異は造血悪性腫瘍に寄与することが実証されており、DNMT3A変異細胞株は同質遺伝子の野生型細胞株と比較してトランスクリプトーム不安定性を示す。 [50]
実際には、癌細胞では正常細胞に比べて選択的スプライシングが減少しており、スプライシングの種類も異なります。たとえば、癌細胞では正常細胞よりもイントロン保持のレベルが高いですが、エクソンスキッピングのレベルは低いです。[51]癌細胞のスプライシングの相違の一部は、スプライシング因子遺伝子の体細胞変異の高頻度による可能性があり、[46]一部はトランスアクティングスプライシング因子のリン酸化の変化から生じる可能性があります。 [33]その他は、生成されるスプライシング因子の相対量の変化によって生じる可能性があります。たとえば、乳癌細胞ではスプライシング因子SF2/ASFのレベルが上昇していることが示されています。[52]ある研究では、比較的少数の割合（26000を超えるうち383）の選択的スプライシングバリアントが正常細胞よりも腫瘍細胞で有意に高い頻度で見られ、誤ってスプライシングされると腫瘍の発生に寄与する遺伝子のセットが限られていることを示唆しています。 [ 53]しかし、誤ってスプライスされた転写産物の有害な影響は、通常、ナンセンス介在mRNA分解[NMD]と呼ばれる細胞転写後品質管理機構によって保護され、除去されると考えられています。[54]
がんに関連する特定のスプライシング変異体の一例は、ヒトのDNMT遺伝子の 1 つにあります。3 つの DNMT 遺伝子は、 DNA にメチル基を追加する酵素をコードしており、この変更はしばしば調節効果を持ちます。腫瘍やがん細胞株には、異常にスプライシングされた DNMT3B mRNA がいくつか見つかります。2 つの別々の研究では、哺乳類細胞でこれらの異常にスプライシングされた mRNA の 2 つを発現すると、それらの細胞内の DNA メチル化パターンに変化が生じました。異常な mRNA の 1 つを持つ細胞は、対照細胞の 2 倍の速さで成長し、この製品が腫瘍の発達に直接寄与していることを示しました。[33]
もう一つの例は、 Ron（MST1R）プロトオンコゲンです。癌細胞の重要な特性は、移動して正常組織に侵入する能力です。異常にスプライスされたRon転写産物の生成は、乳癌細胞におけるSF2/ASFレベルの上昇と関連していることがわかっています。このmRNAによってコードされるRonタンパク質の異常なアイソフォームは、細胞運動性を引き起こします。[52]
FOSB遺伝子の切断型スプライスバリアントであるΔFosBが側坐核の特定のニューロン集団で過剰発現することが、薬物や自然報酬への依存の誘導と維持に関与する原因メカニズムであることが確認されている。[55] [56] [57] [58]
最近の刺激的な研究では、クロマチン構造とヒストン修飾が選択的スプライシング制御において重要な役割を果たすことが示唆されている。これらの知見は、エピジェネティック制御がゲノムのどの部分が発現するかだけでなく、それらがどのようにスプライシングされるかも決定することを示唆している。[59]
ゲノム規模（トランスクリプトーム全体）の解析
トランスクリプトーム全体の選択的スプライシングの解析は、通常、ハイスループットRNAシーケンシングによって行われます。最も一般的なのは、イルミナ機器などのショートリードシーケンシングです。しかし、ナノポアやPacBio機器などのロングリードシーケンシングの方がさらに有益です。トランスクリプトーム全体の解析は、例えば癌コホートなどで逸脱した選択的スプライシングの量を測定するために使用できます。[60]
ディープシーケンシング技術は、未処理および処理済みのmRNAの両方のゲノムワイド解析に使用されており、選択的スプライシングに関する知見を提供しています。たとえば、ディープシーケンシングの使用結果によると、ヒトでは、マルチエクソン遺伝子からの転写産物の約95％が選択的スプライシングを受け、多くのpre-mRNA転写産物が組織特異的にスプライシングされています。[2]機能ゲノミクスとマルチインスタンス学習に基づく計算手法も開発されており、RNA-seqデータを統合して選択的スプライシングされたアイソフォームの機能を予測しています。[36]ディープシーケンシングは、スプライシング中に放出される一時的な投げ縄の生体内検出、分岐部位配列の決定、およびヒトpre-mRNA転写産物の分岐点の大規模なマッピングにも役立っています。[61]
より歴史的には、選択的スプライシングを受けた転写産物はEST配列を比較することによって発見されてきたが、これには膨大な数のESTの配列決定が必要である。ほとんどのESTライブラリは非常に限られた数の組織から得られるため、組織特異的なスプライスバリアントはいずれにしても見逃される可能性が高い。しかし、DNAマイクロアレイベースの分析、RNA結合アッセイ、ディープシーケンシングなど、スプライシングを調査するためのハイスループットアプローチが開発されている。これらの方法は、タンパク質結合に影響を与えるスプライシング要素内またはその周囲の多型または変異をスクリーニングするために使用できる。生体内 レポーター遺伝子アッセイを含むスプライシングアッセイと組み合わせると、多型または変異がpre-mRNA転写産物のスプライシングに及ぼす機能的影響を分析できる。[20] [23] [62]
マイクロアレイ解析では、個々のエクソン（例： Affymetrixエクソンマイクロアレイ）またはエクソン/エクソン境界（例： ExonHitまたはJivanのアレイ）を表すDNA断片のアレイが使用されています。次に、アレイは、関心のある組織からの標識されたcDNAでプローブされます。プローブcDNAは、起源組織のmRNAに含まれるエクソンのDNA、または2つのエクソンが結合した境界のDNAに結合します。これにより、特定の選択的スプライシングmRNAの存在が明らかになります。[63]
CLIP (架橋および免疫沈降) は、スプライシング中に組織内のタンパク質を RNA 分子に UV 照射でリンクします。次に、特定の抗体を使用して、目的のトランスアクティングスプライシング調節タンパク質を沈殿させます。そのタンパク質に付着した RNA を分離してクローン化すると、そのタンパク質のターゲット配列が明らかになります。[64] RNA 結合タンパク質を識別し、pre-mRNA 転写物への結合をマッピングする別の方法は、「Microarray Evaluation of Genomic Aptamers by shift (MEGAshift)」です。net [65]この方法は、「Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment (SELEX)」法[66]をマイクロアレイベースの読み取りと組み合わせて適応させたものです。MEGAshift 法の使用により、ASF/SF2 や PTB などのさまざまなスプライシング因子への結合を媒介する、選択的スプライシングされたエクソンを囲む pre-mRNA 転写物内の配列を識別できるようになり、選択的スプライシングの調節に関する洞察が得られました。[67]このアプローチは、RNAの二次構造とスプライシング因子の結合との関係を決定するのにも役立っています。[22]
レポーターアッセイを使用すると、発生するスプライシング反応に応じて2つの異なる蛍光タンパク質のいずれかを発現するレポーター遺伝子を構築することで、特定の選択的スプライシングイベントに関与するスプライシングタンパク質を見つけることができる。この方法は、スプライシングに影響を与える変異体を分離し、それらの変異体で不活性化された新しいスプライシング制御タンパク質を同定するために使用されている。[64]
タンパク質構造予測の最近の進歩により、ゲノム注釈や選択的スプライシング解析のための新しいツールの開発が促進されました。たとえば、タンパク質構造予測に基づくプラットフォームである isoform.io は、さまざまなヒト組織にわたる多数の RNA シーケンシング実験から集められたヒトタンパク質コード遺伝子の数十万のアイソフォームを評価しました。この包括的な分析により、最新のヒト遺伝子データベースの標準的なアイソフォームと比較して、より確実に構造が予測され、潜在的に優れた機能を持つ多数のアイソフォームが特定されました。構造予測を発現および進化の証拠と統合することにより、このアプローチは、ヒトゲノムの注釈を洗練するためのツールとしてのタンパク質構造予測の可能性を実証しました。[68]
データベース
選択的スプライシングデータベースのコレクションがあります。[69] [70] [71]これらのデータベースは、選択的スプライシングを受けているpre-mRNAを持つ遺伝子や選択的スプライシングイベントを見つけたり、選択的スプライシングの機能的影響を研究したりするのに役立ちます。
- AspicDBデータベース
- Introneratorデータベース
- ProSASデータベース
参照
参考文献
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重要であるにもかかわらず、薬物依存症の根底には生物学的プロセスが関わっています。つまり、乱用薬物への反復暴露によって脆弱な脳に変化が誘発され、薬物の強迫的な探求と摂取、薬物使用に対する制御の喪失が引き起こされ、依存症の状態が定義されます。 ...多くの文献では、D1型NAcニューロンにおけるこのようなΔFosB誘導が、動物の薬物および自然報酬に対する感受性を高め、おそらく正の強化プロセスを通じて薬物の自己投与を促進することが実証されている。
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形成、および AP-1 複合体の形成につながる分子経路は十分に理解されています。 ΔFosB の機能的目的が確立されたことで、GluR2 (87,88)、Cdk5 (93)、NFkB (100) などのエフェクターを含む、その分子カスケードのいくつかの重要な側面についてさらに決定することが可能になりました。さらに、特定されたこれらの分子変化の多くは、慢性的な薬物曝露後に観察される構造的、生理学的、行動的変化に直接関連しています (60,95,97,102)。エピジェネティック研究により、ΔFosB の分子的役割を調査する研究の新たな境地が開かれ、最近の進歩により、ΔFosB が DNA とヒストンに作用して、まさに
分子スイッチ
として機能することが明らかになりました (34)。依存症における ΔFosB の理解が深まった結果、現在の薬物の依存性を評価することが可能になり (119)、治療介入の有効性を評価するためのバイオマーカーとして使用できるようになりました (121,122,124)。提案されている介入法の中には限界があるもの（125）や、まだ初期段階にあるもの（75）もあります。しかし、これらの予備的な研究結果のいくつかが、依存症治療に非常に必要とされている革新的な治療法につながることが期待されています。
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外部リンク
ウィキメディア・コモンズには、選択的スプライシングに関連するメディアがあります。
- SciVeeにおける選択的スプライシング イベントの一般的な定義と命名法
- AStalavista (選択的スプライシング ランドスケープ視覚化ツール) は、選択的スプライシング構造を徹底的に計算して分類する方法です。2009 年 12 月 11 日にWayback Machineにアーカイブされました。
- IsoPred: 計算により予測されたアイソフォーム関数
- Stamms-lab.net: ヒト疾患における選択的スプライシング問題とミススプライシングを扱う研究グループ
- 脳内のイオンチャネルの選択的スプライシングは精神および神経疾患と関連している
- BIPASS: 選択的スプライシングにおける Web サービス