パルスチェイス解析

細胞分裂の方向は、PCAと細胞染色を用いて決定できます。細胞染色は、仮説上の細胞プロセスに関する視覚的なデータを提供し、それを裏付けるためにPCAと併用されます。紡錘体などの細胞のさまざまな部分が染色され、細胞周期のさまざまな段階で画像化されます。この情報は、対応する「パルス」期間と「チェイス」期間のデータとともに使用されます。この特定の実験では、5-エチニル-2'-デオキシウリジン（EdU）を使用してシロイヌナズナの葉細胞を標識します。細胞核が染色され、染色とパルスチェイスのシグナルが比較されました。細胞の分裂角度を使用して、細胞分裂の方向と細胞段階が決定されました。^{[ 7 ]}

細胞のライフサイクルの段階を決定するために PCA を使用する場合、細胞小器官の形態を調べることができます。死細胞や細胞核を画像化するために、DAPI、ヨウ化プロピジウム、またはHoechstなどのさまざまな蛍光細胞染色剤で細胞を染色することができます。この実験では、免疫標識と蛍光染色が併用されます。細胞は EdU で標識されます。この実験は植物細胞、具体的にはシロイヌナズナの根細胞で行われました。細胞は植物から分離され、EdU で免疫標識され、蛍光色素で染色されました。DAPI で画像化された細胞と PCA の結果を比較すると、細胞周期の後期 G1 部分でゴルジ体の量が増加することが示されました。^{[ 8 ]}

免疫沈降法は、溶液中に存在するタンパク質を特定するために使用できます。これは、タンパク質が属する高分子のさまざまな構成要素を分解することによって行われます。PCA を実行する際には、以前に標識されたタンパク質を回収し、タンパク質処理の過程におけるタンパク質の位置を特定するために使用されます。タンパク質高分子は、エンドグリコシダーゼで処理して分解し、SDS-PAGE に通して個々のタンパク質の同一性を決定します。存在する固有のタンパク質のこの情報は、特定の時点でのタンパク質のメカニズムを決定するために使用されます。^{[ 3 ]}ただし、標識されたタンパク質と標識されていないタンパク質の誤同定の懸念があるため、免疫沈降法は常に使用されるわけではありません。^{[ 9 ]}

PCA実験を行う際、細胞は、目的のタンパク質を分離する際に干渉したりノイズを発生させたりする可能性のある細胞外の残骸や物質を洗い流します。しかし、実験で材料を洗浄する場合、15分以上かかることがあります。細胞周期やタンパク質分解などの生物学的プロセスの特定の段階を調べようとする場合、細胞の洗浄に費やす時間が長くなると、実験結果に干渉する可能性があります。パルスチェイス実験は、洗浄を必要としないように変更することができます。研究者らは、蛍光タンパク質と蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を使用してタンパク質を標識する方法を開発しました。求核性酵素を標識し、洗浄の代わりに、ノイズ干渉化合物を脱離反応によって除去しました。このPCAのアプローチは、タンパク質の発現速度や移動速度などの時間依存的なタンパク質反応を明らかにすることができます。^{[ 10 ]}

パルスチェイス解析は、幹細胞の分裂速度を決定するために使用できます。幹細胞は、分裂がまれであるという点で通常の細胞とは異なります。研究者は、幹細胞の細胞周期と細胞寿命を研究するために、マウスとラットの腎臓細胞でパルスチェイス解析を使用しました。ラベル保持細胞（LRC）が幹細胞であるかどうかを判断するために、異なるパルス長が使用されました。タグをより長い期間保持し、「低速サイクル」の細胞は、幹細胞であると仮定されました。パルスは、DNAアナログラベルを検出するため、および細胞の半減期を使用して細胞分裂の回数を検出するためにも使用されました。^{[ 13 ]}

細胞のターンオーバー率はパルスチェイス分析によってモニタリングできます。研究者は、パルスチェイス分析とレーザーアブレーションエレクトロスプレーイオン化質量分析法（LAESI-MS）を組み合わせて、機械的に細胞のターンオーバー率を高めています。光合成を行う緑藻類とクラミドモナス・ラインハルティ細胞を標識するためにアミノ酸が使用されました。同位体標識アミノ酸を追跡するためにパルスチェイス分析が使用されました。これは細胞内の光合成速度と比較され、細胞のライフサイクルの知識に貢献しました。^{[ 14 ]}

プロコラーゲンは結合組織に関連する疾患に関与しているため研究されています。プロコラーゲンはコラーゲンやタンパク質と相互作用し、小胞体やゴルジ体などのさまざまな細胞小器官を通過します。PCAはプロコラーゲンの形成とその形成の阻害を研究するために使用されます。PCAは、細胞の機能を阻害しないように非放射性細胞を使用して行われます。この実験では、DNAへの損傷を避けるためにAHAも使用されます。ヒト細胞を使用して細胞からプロコラーゲンを抽出しました。コラーゲンは蛍光色素で標識されました。染色とパルスチェイス標識に加えて、さまざまな時点でのmRNAとコラーゲンの量を決定するためにRT-qPCRを実行するために、細胞からRNAも分離されました。 ^{[ 15 ] [ 16 ]}

パルスチェイス解析は、ウイルスがどのように複製して細胞に侵入するかを調べるために使用できます。研究者は、インフルエンザAウイルス（IAV）を研究し、感染中の細胞構造を調べるために、光活性化後の蛍光消失（FLAPh）を使用します。光退色後の蛍光回復（FRAP）とは異なり、FLAPhは可動要素を特定できます。ウイルス感染は常に移動しており、移動中にそれを画像化できる方法が必要です。FLAPhはタンパク質成分を短時間だけ光退色させるため、タンパク質と細胞成分の位置を特定するのに適した方法です。これはパルスチェイス解析と組み合わされ、研究者は両方の視覚的方法を使用して、ウイルス感染の各段階における細胞内のタンパク質の分解とウイルスの位置を特定しました。^{[ 17 ]}

主成分分析（PCA）は、タンパク質と相互作用する分子の構造を決定するために使用できます。これは、タンパク質に標識を付けて実験におけるチェイスの長さを分析することによって行うことができ、また、パルスチェイス実験後のタンパク質の量と濃度を分析することによっても行うことができます。