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P19細胞は、マウスの胚由来奇形癌から派生した胚性癌細胞株です。この細胞株は多能性であり、3つの胚葉すべての細胞型に分化することができます。さまざまな化学処理によって心筋細胞や神経細胞に誘導することができます。凝集したP19細胞をジメチルスルホキシド（DMSO）に曝露すると、心筋と骨格筋への分化が誘導されます。レチノイン酸（RA）に曝露すると、神経細胞になります。[ 1 ]
ヒトの癌細胞は、悪性度の高い癌細胞が増殖・転移すると、患者の死に至る可能性があります。しかし、研究者たちはこれらの細胞を利用して癌細胞の発生過程を研究し、より効果的な治療法を見つけようとしています。発生生物学者にとって、奇形腫から派生した胚細胞癌は、発生研究に適した対象です。
1982年、マクバーニーとロジャースは、腫瘍の増殖を誘発するために、 7.5日齢のマウス胚を精巣に移植した。原発腫瘍から、正倍数体核型を持つ未分化幹細胞を含む細胞培養が分離された。これらの幹細胞は、胚性癌P19細胞と名付けられた。[ 2 ]これらの由来のP19細胞は、フィーダー細胞なしで急速に増殖し、維持が容易であった。さらに、P19細胞の多能性は、別のマウス系統の胚盤胞に細胞を注入することによって確認された。研究者らは、受容マウスの体内で3つの胚葉すべてに由来する組織が成長していることを発見した。 [ 3 ]継続的な研究に基づいて、彼らはさらに、元のP19細胞からサブタイプ細胞株であるP19S18、P19D3、P19RAC65、およびP19C16を派生させた。これらのサブタイプ細胞株の違いは、それぞれレチノイン酸またはDMSOによる処理に応答して神経細胞または筋細胞に分化する能力である。[ 3 ] [ 4 ] [ 5 ]最近では、分化したP19細胞から最初に派生した細胞株を生成する様々な研究が行われています。P19細胞の多能性により、これらの新しい派生細胞株は外胚葉、中胚葉、内胚葉様の細胞 になり得ます。[ 6 ]
P19細胞は染色体構成が安定しているため指数関数的に増殖し続けることができます。胚性癌は3つの胚葉すべての細胞に分化できるため、P19細胞も外胚葉、中胚葉、内胚葉様の細胞に分化することができます。胚性癌細胞を高密度で培養すると、分化が始まります。[ 7 ]細胞を胚体へと凝集させることで、EC細胞も分化を進めることができます。[ 8 ] P19細胞では、凝集した胚様体細胞に毒性のない濃度の薬剤を加えることで、添加した薬剤に応じてP19細胞を特定の細胞株へと分化させることができます。[ 1 ]最も一般的で効果的な薬剤は、レチノイン酸（RA）とジメチルスルホキシド（DMSO）です。研究によると、ある濃度のRAはP19細胞を神経細胞（ニューロンやグリア細胞を含む）に分化させるのに有効であることが示されていますが[ 9 ]、0.5%～1%のDMSOはP19細胞を心筋細胞または骨格筋細胞に分化させました。RA処理法では、凝集後にニューロン、アストログリア、線維芽細胞を識別できます。分化した細胞はコリンアセチルトランスフェラーゼとアセチルコリンエステラーゼの活性も持っています[ 10 ] 。DMSOで処理した場合、5日間の曝露後に心筋細胞が発達し、8日間の曝露後に骨格筋細胞が現れました。これらの研究は、薬剤曝露が多能性P19細胞を異なる細胞層に分化させることを示しました。レチノイン酸またはDMSOの濃度は細胞に対して無毒であるため、薬剤特異的分化は細胞の選択ではなく誘導によるものです。薬剤特異的分化のメカニズムを調査するために、P19細胞の変異体が作製されています。[ 10 ]さらに、神経発生や筋発生に関連するシグナル伝達経路も、遺伝子発現の研究やP19細胞の変異体の生成によって調査された。
未分化P19細胞をレチノイン酸で処理すると、特異的に神経細胞に誘導できます。1μMから3μMのRAを使用すると、最も豊富な細胞タイプとして神経細胞が生成されます。[ 4 ] この処理を受けた神経細胞は、6日から9日の間に最も多くなります。神経フィラメントタンパク質、HNK-1抗原、破傷風毒素結合部位などのいくつかの神経マーカーは、これらの日に最も高いレベルで発現します。[ 11 ] 6日から9日の処理後、相対的な神経細胞数は減少しますが、これは非神経細胞の増殖が速いためと考えられます。10日間の曝露後、グリア細胞の特異的マーカーであるグリア線維性酸性タンパク質（GFAP） を使用してアストログリア細胞を検出できます。P19細胞は、ニューロンやアストロサイト以外にも、オリゴデンドロサイトにも分化することができ、これはミエリン関連糖タンパク質や2',3'-環状ヌクレオチド3'-ホスホジエステラーゼといった特異的なマーカーを用いて検出できる。さらに、 RA誘導細胞をマウスの脳に移植すると、オリゴデンドロサイトも発達し、線維束へと移動した。[ 12 ] レチノイン酸は、P19細胞だけでなく、他の前駆細胞や胚性幹細胞の分化も誘導することができる。レチノイン酸処理後の細胞は、すぐにニューロンマーカー遺伝子を発現しなかったため、RAは細胞分化を処理する何らかの経路を開始する必要がある。多くの研究では、レチノイン酸受容体遺伝子の変異アレルを生成し、RAに曝露しながら受容体遺伝子、 Hox遺伝子、レチノール結合タンパク質の発現を研究するなど、RA誘導メカニズムを調査するためにP19細胞が使用されている。[ 13 ] [ 14 ]
これらの研究はすべて、P19細胞が特定の細胞経路に干渉する薬剤のメカニズムを調査するための優れたin vitroモデルシステムであることを示している。さらに、P19細胞におけるRA誘導神経新生の能力を利用して、多くの研究者が神経新生またはグリア新生のin vitro分化メカニズムの特定を開始した。Wnt/β-カテニン経路、Notch経路、ヘッジホッグ経路など、いくつかの関連経路が、遺伝子発現または関連遺伝子の対立遺伝子の生成を使用して調査されている。[ 15 ] [ 16 ] [ 17 ]
レチノイン酸と同様に、DMSO誘導分化はP19細胞に特異的ではありません。神経芽細胞腫細胞、肺癌細胞、マウスES細胞も誘導する可能性があります。[ 18 ] [ 19 ] [ 20 ] 0.5～1%の濃度でDMSOはP19細胞を凝集させ、中胚葉および内胚葉細胞型に処理しました。[ 1 ] [ 10 ] [ 21 ]凝集と分化中に起こる細胞メカニズムはまだ完全には研究されていません。しかし、いくつかの研究では、細胞間コミュニケーションがP19細胞の筋分化において重要な役割を果たしている ことが示されており、これが筋分化を処理するために細胞が最初に凝集する必要がある理由を説明できる可能性があります。[ 6 ] P19細胞における筋形成のメカニズムを解明するために、GATA-4、MEF2c、Msx-1、Nkx2.5、MHox、Msx-2、MLPなどのいくつかの心臓特異的転写因子が分化中に変化することがわかっています。 [ 6 ]報告によると、GATA-4、NKx2.5、MEF2cはすべてDMSO誘導後にアップレギュレーションされました。[ 22 ] [ 23 ]近年、P19細胞は心臓分化と筋形成のメカニズムの研究にも使用されています。主な影響を受けるシグナル伝達経路である骨形成タンパク質（BMP）経路は、P19細胞で最も強く研究されているシグナル伝達です。 BMP拮抗物質であるノギンを過剰発現するP19CL6noggin細胞株を作製することで、変異細胞は1%のDMSOで処理しても心筋細胞に分化しないことがわかり、このシステムではBMPが心筋細胞分化に不可欠であることが示唆された。また、TAK1、Nkx-2.5、GATA-4が心臓形成BMPシグナル伝達経路において重要であることを示す証拠も提供した。 [ 24 ]
P19細胞は、試験管内で神経細胞と筋細胞の両方を効率的に形成できるという利点があります。P19細胞は他の胚性幹細胞に比べて維持・培養が容易であるため、試験管内での発生研究に便利なモデルとなります。この細胞株を操作して特定の遺伝子を発現させたりノックアウトしたりする技術を用いることで、シグナル伝達経路、機能的側面、筋発生および神経発生におけるタンパク質発現の調節機構を詳細に調べることが可能になります。さらに、この研究を発展させることで、心臓や脳の発達・成熟の後期段階を解明することもできます。