機械灌流

機械灌流（MP）は、臓器移植を容易にするために臓器保存によく使用される人工灌流技術です。MPは、ドナー臓器に特殊な溶液を継続的に送り込み、体内の自然な血流を模倣しながら、臓器内の温度、酸素レベル、化学組成、機械的ストレスを積極的に制御します。機械灌流は、体外で臓器の生存能力を長期間維持することで、保存時間の制限など、臓器移植における重要な課題に対処します。^{[1] [2] [3]}

機械灌流には様々な形態があり、灌流液の温度によって冷温（4℃）と温温（37℃）に分類できます。^{[4]機械灌流は}腎移植、^[5] 肝移植^[6]および肺移植^[7]に適用されています。これは静的冷蔵保存（SCS） の代替手段です。

2022年には、通常12時間未満である肝臓の機械灌流を3日間行った記録的なヒト移植臓器保存が報告された。低温保存法によって10日間まで延長でき、大幅な細胞損傷を防ぐことができる可能性がある。 ^{[8] [9]}代替アプローチとしては、新しい凍結保護溶媒が挙げられる。^{[10] [11]}

開発中の新しい臓器灌流システムがあり、これは死後1時間（その間、体は長時間の温熱虚血状態にあった）で複数の重要な（豚の）臓器を細胞レベルで回復させることができる。 ^{[12] [13]}また、死後数時間で（豚の）脳を蘇生させる同様の方法/システムもある。^{[12] [14]この細胞回復システムは、}ドナー臓器の保存や医療上の緊急事態における蘇生治療に使用できる可能性がある。^[12]

腎臓の保存と移植の発展に不可欠な準備として、血管吻合法を開発したアレクシス・カレルの研究がありました。^[15]カレルは1902年に犬で行われた最初の腎臓移植について説明しました。ウルマン^[16]も同じ年に同様の実験を独自に説明しました。これらの実験では、腎臓は保存を試みることなく移植されました。

腎臓の体外保存を可能にする決定的なステップは、1943年にファーマンが、単離した組織の代謝プロセスに対する低体温の可逆的な影響を実証したことでした。[17]これに先立ち、腎臓は血液または希釈した血液灌流液を使用して常温で保存されていましたが、[ 18 ^{] [ 19]}再移植は成功していませんでした。ファーマンは、ラットの腎臓皮質と脳のスライスが0.2℃までの冷却に1時間耐え、その温度では酸素消費が最小限であることを示しました。スライスを37℃に再加熱すると、酸素消費は正常に戻りました。

低体温が虚血性無傷腎臓に及ぼす有益な効果は、 1955年にオーウェンズによって実証されました^[20]。オーウェンズは、犬を23〜26℃に冷却し、胸部大動脈を2時間閉塞した場合、犬を再加温したときに腎臓に明らかな損傷が見られないことを示しました。腎臓の虚血性損傷に対する低体温のこの保護効果は、ボガーダス^[21]によって確認されました。ボガーダスは、2時間腎茎をその場でクランプした犬の腎臓の表面冷却による保護効果を示しました。モイヤー^[22]は、同じ期間の低体温虚血から犬と人間の腎機能に同じ効果を示すことで、これらの犬の実験が人間にも適用できることを示しました。

1958年になって初めて、損傷のないイヌの腎臓は、より低い温度に冷却すると虚血に対してさらによく耐えることが示されました。Stueber ^{[23] は、}腎臓を冷却ジャケットに入れて0〜5℃に冷却すると、腎臓は腎茎をその場でクランプした状態で6時間耐えることを示し、Schloerb ^{[24] は、ヘパリン化した}イヌの腎臓を2〜4℃に冷却する同様の技術で8時間は保護されるが12時間は保護されないことを示しまし た。Schloerb はまた、冷却した腎臓の体外保存と自家移植を試み、4時間の腎臓保存に続いて再移植と即時対側腎摘出を行った後、1匹の長期生存を得ました。彼はまた、腎臓で 後期動脈血栓症を発症したイヌで、24時間の腎臓保存と遅延対側腎摘出の後、ほぼ生存しました。

これらの表面冷却法は、保存前に腎臓の血管系を冷たい液体で洗い流す技術の導入によって改善されました。これにより、腎臓の冷却速度が上がり、血管系から赤血球が除去されました。Kiser ^{[25] は}この技術を使用して、保存前にデキストランと希釈血液の混合物で腎臓を 5 °C で洗い流し、犬の腎臓を 7 時間体外保存することに成功しました。1960 年に Lapchinsky ^[26]は、腎臓を 2 ～ 4 °C で 28 時間保存し、その後自家移植と遅延対側腎摘出を行った犬 8 匹が生存したと報告し、同様の保存期間が可能であることを確認しました。ラプチンスキーは論文の中で詳細を述べていないが、ハンフリーズ^[27]はこれらの実験では腎臓を冷血で1時間冷却し、その後2〜4℃で保存し、再移植時に温かい血液で1時間かけて腎臓を再加温したと報告している。対側腎摘出は2ヶ月延期された。

ハンフリーズ^[27]は、保存期間中腎臓を継続的に灌流するこの保存技術を開発した。彼は灌流液として希釈血漿または血清を使用し、腎臓の腫れを防ぐために灌流液圧を低くする必要があることを指摘したが、灌流液の温度、Po2、流量などの変数の最適値は不明のままであることを認めた_。この時点での彼の最高の結果は、腎臓を4〜10℃で24時間保存し、その後自家移植と数週間後の対側腎摘出を行った後、2匹の犬が生き延びたことだ。

カルン^[28]は、12時間の保存がはるかに簡単な技術で達成できることを実証し、連続灌流法を使用する必要性に異議を唱えました。カルンは、再移植手術と同時に対側腎摘出術を行った場合でも、片方の腎臓が生命を維持していました。カルンは、イヌの腎臓をヘパリン化し、4℃の氷水で保存しただけでした。腎摘出を遅らせた1つの実験では17時間の保存が可能であることが示されましたが、24時間保存では成功しませんでした。

^{次の進歩は1964年にハンフリーズ[29]}によってなされました。彼は独自の持続灌流システムで使用されていた灌流液を改良し、再移植と同時に即時対側腎摘出術を行った場合でも、24時間保存後もイヌの腎臓が生命を維持できるようにしました。これらの実験では、10℃でTis-U-Sol溶液で50％希釈された自己血が灌流液として使用されました。灌流圧は40mmHg、灌流液pHは7.11-7.35（37℃時）でした。血液の損傷を避けるために、酸素供給には膜型肺が使用されました。

これらの結果を改善するために、マナックス^[30]は高圧酸素の効果を調査し、腎臓をデキストラン/Tis-U-Sol溶液でフラッシュしてから7.9気圧で保存し、反対側の腎摘出を移植後2～4週間遅らせれば、連続灌流を使用せずに2℃でイヌの腎臓を48時間保存できることを発見した。マナックスは、高圧酸素は代謝を阻害するか、腎臓細胞への酸素の拡散を促進することによって作用する可能性があると仮定したが、彼のモデルの他の側面が高圧よりも重要であるかどうかを判断するための対照実験は報告していない。

1967年、ベルツァーは犬の血漿をベースとした灌流液を用いて8～12℃で連続灌流を再開し、腎臓を72時間保存することに成功したと報告し、保存期間の顕著な改善を達成しました[31]。ベルツァー^{[ 32]}は、72時間灌流を問題なく行うための重要な要因は、灌流液に使用した血漿を凍結沈殿させることで、溶液から沈殿して腎臓の血管系を徐々に閉塞する不安定なリポタンパク質の量を減らすことであったことを発見しました。凍結沈殿ではリポタンパク質の35%しか除去されなかったため、リポタンパク質の変性を防ぐさらなる試みとして、膜型酸素化装置もシステムで使用されました。灌流液は、1リットルの犬血漿、4mEqの硫酸マグネシウム、250mLのデキストロース、80単位のインスリン、200,000単位のペニシリン、および100mgのヒドロコルチゾンから構成されていました。灌流液は凍結沈殿されているだけでなく、使用直前に0.22ミクロンのフィルターで濾過されていました。ベルツァーは、脈動灌流液流を生成する機械で、灌流液のpHを7.4〜7.5、Po ₂を150〜190mmHg、灌流液圧を収縮期50〜80mmHgに設定しました。このシステムを使用して、ベルツァーは、72時間腎臓を保存してから再移植し、再移植手術で直ちに対側腎摘出を行った犬6匹を生き延びさせました。

ベルツァーが保存の補助としてヒドロコルチゾンを使用することは、イヌの腎臓切片を用いたロトケの研究^[33]によって示唆されていた。この研究では、切片を 2～4 °C で 30 時間保存すると、ヒドロコルチゾンによって PAH と酸素を排出する能力が向上した。ロトケは、これらの実験ではヒドロコルチゾンがリソソーム膜安定剤として作用している可能性があると示唆した。ベルツァーのモデルのその他の要素は経験的に導き出された。インスリンとマグネシウムは、人工冬眠を誘発する試みの一環として部分的に使用された。スオマライネン^[34]は、この方法が自然冬眠動物の冬眠誘発に効果的であることを発見した。マグネシウムは、イヌの心臓保存にマグネシウムが有効な薬剤であることをカミヤマが実証したこと^{[35]を受けて、代謝阻害剤としても提供された。マグネシウムを使用するさらなる根拠は、}血漿中でクエン酸に結合していたカルシウムを補充するために必要だったことであった。

ベルツァー^[36]は、犬の腎臓に使用したのと同じ保存技術を使用して人間の腎臓移植の経験を報告し、犬の実験が人間の腎臓の保存に適用できることを実証しました。ドナーの準備が十分に整っていた場合、彼は腎臓を最大50時間保存することができ、術後の透析を必要とした患者はわずか8%でした。

1968年、ハンフリーズ^[37]は、余分な脂肪酸を含む希釈血漿培地を使用して、10℃の灌流装置で5日間腎臓を保存した後、14匹の犬のうち1匹が生存したと報告しました。しかし、これらの実験では、成功するために再移植後4週間で遅延対側腎摘出が必要であり、これは腎臓が保存中に重度の損傷を受けたことを示しています。

1969年にコリンズ^[38]は、低体温腎臓保存の単純な非灌流法で達成できる結果の改善を報告した。彼は、保存中の腎臓からの電解質の損失は、細胞内に通常存在する量に近い量の陽イオンを含む保存液を使用することで防ぐことができるというケラー^[39 ]の観察に基づいて自分の技術を開発した。コリンズのモデルでは、イヌは腎摘出前に十分に水分補給され、利尿を誘発するためにマンニトールも投与された。血管拡張薬およびリソソーム酵素安定剤であるフェノキシベンザミン^{[40] [41]}が腎摘出前に腎動脈に注入された。腎臓は摘出後すぐに生理食塩水に浸され、100cmの高さから100～150mLの冷たい電解質溶液が腎動脈を通して灌流された。保存期間中、腎臓は氷冷した生理食塩水に浸されたままであった。これらの成功した冷灌流に使用された溶液は、多量のカリウムとマグネシウムを含むことによって細胞内液の電解質組成を模倣した。溶液には、グルコース、ヘパリン、プロカイン、フェノキシベンザミンも含まれていた。溶液のpHは25℃で7.0であった。コリンズは、6つの腎臓を24時間、3つの腎臓を30時間保存することに成功し、腎臓は、直ちに反対側の腎摘出を行ったにもかかわらず、再移植後すぐに機能していた。コリンズは、リンゲル液フラッシュで得られた結果が不良であることを強調し、表面冷却のみで治療した腎臓と比較して、この管理で同様の結果が得られたことを見出した。Liu ^[42]は、アミノ酸とビタミンを含めることで溶液を修正すると、コリンズの溶液は48時間の保存に成功したと報告した。しかし、Liuはこれらの修正が重要であることを示す対照実験を行わなかった。

他の研究者たちは、ベルツァーの成功した 72 時間灌流保存実験を再現するのは難しいことを発見した。ウッズ^[43]は、低温灌流システムで灌流液としてベルツァー添加剤を凍結沈降血漿とともに使用して、6 つの腎臓のうち 3 つを 48 時間保存することに成功したが、ベルツァーが行ったように保存時間を 72 時間まで延長することはできなかった。しかし、ウッズ^[44]は後にイヌの腎臓を 3 日間および 7 日間保存することに成功した。ウッズは、ベルツァーの灌流液にメチルプレドニゾロン 250 mg を添加して改変し、硫酸マグネシウム含有量を 16.2 mEq に、インスリンを 320 単位に増やした。6 つの腎臓のうち 6 つは、直ちに反対側の腎摘出を行ったにもかかわらず、72 時間保存後に再移植したときに生命維持機能を回復した。 2 つの腎臓のうち 1 つは 96 時間保存後、1 つは 120 時間保存後、1 つは 168 時間保存後に生命維持機能を回復しました。灌流液の圧力は 60 mm Hg で、灌流液ポンプの速度は 1 分間に 70 回、灌流液の pH は CO2 滴定装置によって自動的に 7.4 に維持されました_。ウッズはドナー動物とレシピエント動物の水分補給の重要性を強調しました。メチルプレドニゾロンなしでは、保存時間が 48 時間を超えると血管の脆弱性が問題になることをウッズは発見しました。

1972年にジョンソン^{[45]とクレス[46]}はアルブミンベースの灌流液を導入し、低体温灌流保存技術を大幅に簡素化しました。この灌流液により、ベルツァーが使用した凍結沈殿およびミリポア濾過血漿の製造が不要になりました。この灌流液の調製は手間と時間がかかり、肝炎ウイルスや細胞傷害性抗体の潜在的なリスクがありました。灌流液にリポタンパク質が含まれていないため、リポタンパク質の沈殿を防ぐために灌流液/空気界面を避ける必要がなくなり、膜型酸素化装置を灌流回路から排除できました。両研究者はベルツァーが推奨したのと同じ添加剤を使用しました。

ジョンソンが使用した溶液は、血液製品研究所（エルストリー：イギリス）が、熱に不安定なフィブリノーゲンとガンマグロブリンを血漿から抽出して血漿タンパク質分画（PPF）溶液にすることで調製された。この溶液は、血清肝炎の病原体を不活性化するために、60℃で10時間培養された。^[47]その結果、少量のガンマグロブリンとベータグロブリンを含む45g/Lのヒトアルブミン溶液が得られた。この溶液は、0℃から30℃の間で5年間安定していた。^[48] PPFには、2.2mmol/Lの遊離脂肪酸が含まれていた。^[49]

^{ジョンソン[45]}の実験は、主に長時間の温熱障害によって損傷した腎臓の保存に関するものであった。しかし、温熱障害を受けていない犬の腎臓の対照群では、ジョンソンはPPF灌流液を使用すると24時間の保存が容易に達成できることを示し、別の場所で^[50] 、 72時間の灌流と再移植、および即時対側腎摘出後の生存について述べている。温熱障害を受けた腎臓では、PPF灌流はコリンズ法よりも良い結果をもたらし、40分間の温熱障害と24時間保存、続いて腎臓の再移植と即時対側腎摘出の後、6匹中6匹が生存した。PPF溶液には、エネルギー源を提供し、細胞内カリウムの漏出を防ぐために、カリウム、マグネシウム、インスリン、グルコース、ヒドロコルチゾン、およびアンピシリンが添加された。灌流液の温度は6℃、圧力は40～80mmHg、Po2は₂₀₀～400mmHgでした。pHは7.2～7.4に維持されました。

Claes ^[46]は、ヒトアルブミン（スウェーデンのカビ）をベースとした灌流液を生理食塩水で45g/Lに希釈して使用しました。Claesは5匹の犬の腎臓のうち4匹を96時間保存し、再移植直後に反対側の腎摘出を行ったにもかかわらず、腎臓は機能していました。Claesはまた、この灌流液を対照群のベルツァーの凍結沈降血漿と比較し、2つのグループの再移植腎臓の機能に有意差はないことを発見しました。

ウッズらの他に腎臓の7日間保存に成功したと報告した唯一のグループは、1973年のリューとハンフリーズ^[51]である。彼らは7匹の犬のうち3匹を生き延びさせ、腎臓を7日間保存した後、再移植と直ちに対側腎摘出を行った。最も成績の良かった犬は、再移植後のクレアチニンのピークが50 mg/L（0.44 mmol/L）であった。リューはマンニトール利尿を受けている水分補給が十分な犬を使用し、ヒトPPFから得た灌流液を使用して腎臓を9 °C～10 °Cで保存した。PPFは、高水溶性ポリマー（プルロニックF-38）を使用してさらに分画され、低温殺菌を可能にするために安定剤としてアセチルトリプトファン酸ナトリウムとカプリル酸ナトリウムがPPFに添加された。この溶液に、ヒトアルブミン、ヘパリン、マンニトール、グルコース、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、インスリン、メチルプレドニゾロン、カルベニシリン、水を加えて、浸透圧を 300～310  mosmol / kg に調整した。灌流液は 3.5 日保存した後に交換した。灌流液の圧力は 60 mm Hg 以下、ポンプ速度は 60 / 分であった。灌流液の pH は 7.12～7.32 (37 °C 時)、Pco2 は 27～47 mm Hg、Po _{2 は}173～219 mm Hg であった。この研究に関するさらなる報告で、ハンフリーズ^{[52] は}、新しいバッチの PPF で実験を繰り返したところ生存細胞が得られず、元の実験で生存した細胞の組織学的検査で糸球体の細胞過形成が見られ、これはプルロニックポリマーの毒性効果による可能性があると結論付けた。

JoyceとProctor ^[53]は、デキストランをベースとした単純な灌流液を使用して犬の腎臓を72時間保存することに成功したと報告した。17個の腎臓のうち10個が、再移植および即時の対側腎摘出後に生存可能であった。Joyceは、デキストラン70（Pharmacia）2.1％、追加の電解質、グルコース（19.5g / L）、プロカイン、およびヒドロコルチゾンを含む灌流液を使用して、4°Cで非脈動灌流を使用した。灌流液には血漿または血漿成分は含まれていなかった。灌流液圧はわずか30cmH2O _、 pH 7.34〜7.40、Po ₂ 250〜400mmHgであった。この研究は、72時間の保存にはグルコース以外の栄養素は必要なく、低い灌流圧と流量で十分であることを示した。

1973年、サックス^[54]は、新しい洗浄液を腎臓の初期冷却と洗浄に使用すれば、単純な氷保存が72時間の保存に有効であることを示した。サックスは、マンニトール注入後に利尿している水分補給済みのイヌから腎臓を摘出し、100cmの高さから200mLの洗浄液で腎臓を洗浄した。その後、腎臓はそれ以上灌流せずに2℃で72時間保存した。再移植後、直ちに反対側の腎摘出を行った。洗浄液は細胞内液の組成を模倣するように設計され、細胞の膨張をさらに防ぐために不浸透性イオンとしてマンニトールを含んでいた。溶液の浸透圧は430 mosmol/kgで、2℃でのpHは7.0であった。コリンズが使用した添加物（デキストロース、フェノキシベンザミン、プロカイン、ヘパリン）は、サックスでは省かれた。

^{これらの結果はロス[55]}によっても達成され、ロスは持続灌流を使用せずに72時間の保存に成功したが、オリジナルのコリンズまたはサックスの溶液を使用してコリンズまたはサックスの結果を再現することはできなかった。ロスの成功した溶液は、高張クエン酸とマンニトールを添加した細胞内液と電解質組成が似ていた。溶液にはリン酸塩、重炭酸塩、塩化物、ブドウ糖は存在せず、浸透圧は400 mosmol/kg、pHは7.1であった。8匹中5匹の犬は、ロスの溶液でフラッシュした後腎臓を72時間保存したところ、腎臓の再移植と即時対側腎摘出を乗り越えたが、ロスは遅延対側腎摘出を使用した場合でもこの技術で7日間の保存を達成できなかった。

72時間の低体温灌流保存を成功させるための要件は、コリンズによってさらに定義され、灌流液圧を49 mmHgにすれば脈動灌流は必要なく、保存には2 °Cや12 °Cよりも7 °Cの方が適していることが示されました。^{[56] [57]}彼はまた、さまざまな灌流液の組成を比較し、リン酸緩衝灌流液がうまく使用できることを発見し、二酸化炭素供給の必要性を排除しました。^[56]グルンドマン^[58]も、低い灌流液圧で十分であることを示しました。彼は72時間灌流で平均脈動圧20 mmHgを使用し、これが平均圧15、40、50、または60 mmHgよりも良い結果をもたらすことを発見しました。

^{コーエン[59]}は、様々なタイプの灌流液を使用して最大8日間の保存に成功したと報告しており、8℃でリン酸緩衝灌流液を使用した場合に最良の結果が得られました。これらの成功した実験を繰り返すことができなかったのは、PPFの製造方法が変更され、オクタン酸含有量が高くなり有害になったためだと考えられています。オクタン酸は低体温灌流中に代謝活動を刺激できることが示されており^[60]、これが有害である可能性があります。

損傷を受けていない腎臓を 72 時間低温保存すると構造変化が起こることが Mackay ^[61]によって説明されており、細胞の細胞質が徐々に空胞化し、特に近位尿細管に影響を及ぼしていることが示されています。電子顕微鏡検査では、ミトコンドリアが膨張し、内部の結晶膜が早期に分離し、後にすべての内部構造が失われているのが見られました。リソソームの完全性は後期までよく保たれており、細胞の破壊は溶解酵素によって引き起こされたようには見えませんでした。なぜなら、リソソームのすぐ隣には細胞の他の部分よりも大きな損傷がなかったからです。^{[引用が必要]}

ウッズ^{[44] [62]}とリュー^[51]は、5日間と7日間の腎臓保存の成功について記述した際に、灌流終了時と死後に見られる光学顕微鏡的変化について記述したが、リンパ球の浸潤と時折見られる尿細管萎縮を除けば、肉眼的異常はほとんど見られなかった。

再移植前のヒト腎臓の短時間灌流中の変化は、再移植後1時間で生検も行ったヒル^[63]によって記述されている。電子顕微鏡検査でヒルは、再移植後のフィブリン沈着の重症度と相関する内皮損傷を発見した。ヒルが光学顕微鏡で糸球体に観察した変化は、時折見られるフィブリン血栓と多形体による浸潤であった。ヒルはこれらの変化が免疫学的に誘発された病変であると疑ったが、組織学的病変の重症度と免疫グロブリン沈着の有無との間には相関がないことを突き止めた。^[要出典]

灌流保存中の腎臓で生成された尿の分析に関する報告がいくつかある。Kastagir ^{[64] は}24 時間灌流中に生成された尿を分析し、それが灌流液の限外濾過物であることを発見し、Scott ^{[65] は}24 時間保存中の尿中に微量のタンパク質を発見し、Pederson ^[66]は 36 時間灌流保存後に微量のタンパク質のみを発見した。Pederson は以前の実験で重度のタンパク尿を発見したと述べた。Woods ^{[62] は}5 日間保存後の生存腎臓の尿細管にタンパク質円柱があることに気付いたが、灌流中に生成された尿を分析しなかった。Cohen の研究^[59]では、8 日間保存中に尿タンパク質濃度が徐々に増加し、尿のタンパク質含有量が灌流液のタンパク質含有量に等しくなった。これは、同じ灌流保存期間中に観察された糸球体基底膜の腫脹と上皮細胞足突起の進行性融合に関連している可能性があります。

低体温保存中に腎臓に損傷を与えるメカニズムは、以下のように分類できます。

1. 細胞の代謝プロセスへの損傷は以下によって引き起こされます:
   1. 寒い
   2. 低体温保存期間の前後で腎臓が温かい場合の無酸素状態。
   3. 適切な栄養素を供給できない。
   4. 灌流液中の毒素の蓄積。
   5. 貯蔵液による毒性損傷。
   6. 腎臓細胞からの必須基質の洗い流し。
2. 核DNAの損傷。
3. 低体温灌流中の腎臓の血管系の機械的損傷。
4. 再移植後の損傷。

常温では、細胞壁のポンプ機構により細胞内のカリウムが高レベルで保持され、ナトリウムが排出される。これらのポンプが機能しなくなると、ナトリウムは細胞に取り込まれ、カリウムが失われる。水は受動的にナトリウムを追い、細胞の膨張を引き起こす。この細胞膨張の制御の重要性は、犬の腎皮質水分含有量と36時間保存後の腎臓の生命維持能力との間に有意な相関関係があることを発見したMcLoughlin [67 ^]によって実証された。ポンプ機構はNa+K+活性化ATPase ^[68]として知られる酵素系によって駆動され、寒さによって阻害される。Levy ^{[69] は}、酸素消費量測定によって示される10 °Cでの代謝活動が正常の約5%に低下することを発見し、すべての酵素系が低体温によって同様に影響を受けるため、ATPase活性は10 °Cで著しく低下する。

しかし、この ATPase の低温感受性には組織や種による違いがあり、それが組織の低体温耐性能力の違いを説明できるかもしれない。Martin ^[70]は、イヌの腎臓皮質細胞では、10 °C でも ATPase 活性がいくらか残っているが、0 °C では残っていないことを示した。肝臓と心臓の細胞では、10 °C で活性が完全に阻害され、ATPase の低温感受性のこの違いは、肝臓と心臓の細胞を低温で保存する際の細胞膨張の制御がより困難になることと相関していた。血管壁には独特の ATPase が見つかり、これは Belzer ^[71]によって10 °C で完全に阻害されることが示されたが、この温度では腎臓皮質細胞の ATPase はまだ活性である。これらの実験は大動脈内皮で行われたが、腎臓の血管内皮が同じ特性を持っている場合、血管の損傷が腎臓の長期保存の制限要因となる可能性がある。

ウィリス^[72]は、冬眠動物が低温で生存する能力の一部は、5℃で非冬眠動物の約6倍の速さで細胞膜を介してナトリウムとカリウムを活発に輸送できるNa+K+-ATPaseを持つことで得られることを示した。この輸送速度は細胞の膨張を防ぐのに十分である。

組織の冷却速度も酵素システムの損傷に大きく影響する可能性がある。フランカビラ^[73]は、肝臓切片を急速に冷却した場合（6分で12℃まで即時冷却）、37℃まで再加温した際に測定された嫌気性解糖は、遅延冷却を受けた切片で示された活性の約67％まで阻害されたことを示した。しかし、イヌの腎臓切片は、肝臓切片ほど急速冷却による影響を受けなかった。

すべての細胞は、代謝活動のエネルギー源として ATP を必要とします。腎臓皮質細胞が嫌気条件下で細胞のニーズを満たすのに十分な ATP を生成できない場合、腎臓は無酸素症によって損傷を受けます。腎臓を切除する場合、腎動脈を切断してから腎臓を冷却するまでの間に、ある程度の無酸素症は避けられません。Bergstrom ^[74]は、イヌの腎臓の皮質細胞の ATP 含有量の 50% が腎動脈をクランプしてから 1 分以内に失われることを示しており、Warnick ^[75]はマウス全体の腎臓で同様の結果を発見しており、温かい無酸素状態で約 30 秒後に細胞 ATP が 50% 減少しました。Warnick と Bergstrom はまた、腎臓を摘出した直後に冷却すると、それ以上の ATP 損失が大幅に減少することを示しました。これらの温熱障害を受けていない腎臓を酸素化低体温血漿で灌流すると、24時間保存後、ATPレベルは50%減少し、48時間後には組織平均ATPレベルがこれよりわずかに高くなり、ATP合成が起こったことが示された。ペッグ^[76]は、ウサギの腎臓は温熱障害後の灌流保存期間後にATPを再合成できるが、温熱障害を受けていない腎臓では再合成は起こらないことを示した。

温熱性低酸素症は、保存後の腎臓の再移植時にも起こる可能性がある。ラノン^[77]は、コハク酸代謝の測定により、保存直前に起こる同じ期間の温熱性低酸素症よりも、保存後に起こる期間の温熱性低酸素症に対して腎臓がより敏感であることを示した。

^{重炭酸塩の生成を伴うグルコースの活発な代謝はペッターソン[78]}とコーエン^[59]によって実証されている。

ペッターソンの研究^[78]は、6日間の低体温灌流保存中の腎臓によるブドウ糖と脂肪酸の代謝に関するもので、腎臓はブドウ糖を4.4μmol/g/日、脂肪酸を5.8μmol/g/日消費したことがわかった。コーエンの研究^[59]では、8日間保存した腎臓のブドウ糖消費量はそれぞれ2.3μmol/g/日と4.9μmol/g/日であり、ペッターソンの犬の腎臓と同程度の脂肪酸消費量であった可能性が高い。ブドウ糖消費量と重炭酸塩生成量の両方の一定率は、解糖酵素や炭酸脱水酵素系に損傷が及んでいないことを示唆している。

Lee ^{[79] は}、常温ではウサギの腎皮質の好ましい基質は脂肪酸であり、通常は嫌気的に代謝する髄質細胞の好ましい基質はグルコースであることを示した。Abodeely ^[80]は、ウサギの腎臓の外髄質では脂肪酸とグルコースの両方が利用できるが、グルコースが優先的に利用されることを示した。低体温では腎臓の代謝ニーズは大幅に減少するが、グルコース、脂肪酸、ケトン体の消費が測定可能となる。Horsburgh ^[49]は、低体温の腎臓では脂質が利用され、15 °C のラット腎皮質ではパルミチン酸の消費が正常の 0～15% であることを示した。Pettersson ^{[78] は}、モル基準で、低体温灌流腎臓ではグルコースと脂肪酸がほぼ同じ速度で代謝されることを示した。黄^[81]は、低体温の犬の腎臓の皮質は、腎臓灌流液にオレイン酸を加えないと脂質を失う（24時間後に総脂質の35%を失う）ことを明らかにした。黄は、この損失が細胞の構造に影響を与える可能性があり、腎臓が脂肪酸を利用していることも示唆しているとコメントした。黄^[82]はその後の論文で、犬の腎臓皮質切片は10℃で脂肪酸を代謝するが、グルコースは代謝しないことを示した。

適切な栄養素が供給されたとしても、保存システムのチューブに吸収されて失われる可能性がある。Lee ^[83]は、シリコンゴム（腎臓保存システムで広く使用されている材料）が4時間の灌流後に灌流液のオレイン酸の46％を吸収することを実証した。

Abouna ^[84]は、3 日間の腎臓保存中に灌流液にアンモニアが放出されたことを示し、灌流液を頻繁に交換して除去しないと、腎臓細胞に有毒である可能性があると示唆しました。長時間灌流中の灌流液交換の使用をある程度裏付けたのは、7 日間の保存実験で灌流液交換を使用したLiu ^{[51]です。Grundmann [85]}も、2 倍の量の灌流液を使用するか、灌流液を交換すると、96 時間保存の品質が向上することを発見しました。しかし、Grundmann の結論は、わずか 3 匹の犬からなる対照群との比較に基づいています。Cohen ^{[59] は}、8 日間の灌流中にアンモニアが生成されることを実証できず、灌流液交換による利点も示しませんでした。灌流中に発生したアルカリ度の進行は、重炭酸塩の生成によるものであることが示されました。

特定の灌流液は、その配合に特定の化学物質が不注意に含まれた結果、腎臓に毒性があることが示されています。Collins ^[86]は、彼のフラッシュ液の配合に含まれるプロカインが有毒である可能性があることを示し、Pegg ^{[87] は}、PVC 可塑剤などの有毒物質が灌流回路のチューブから洗い流される可能性があると述べています。Dvorak ^{[88] は、 Woods [62]}が必須と考えていた灌流液へのメチルプレドニゾロンの添加が、状況によっては有害になる可能性があることを示しました。彼は、650 mL の灌流液に 100 g を超えるメチルプレドニゾロン (Woods は 1 リットルあたり 250 mg を使用) を加えると、灌流 20 時間後に腎臓で不可逆的な血行動態および構造変化が生じることを示しました。毛細血管ループの壊死、ボーマン腔の閉塞、基底膜の肥厚、および内皮細胞の損傷が認められました。

^{ウォーニック[75]}は、保存後に細胞内に残っているヌクレオチドのレベルが、細胞が再加温後にATPを再合成して回復できるかどうかを決定する上で重要であると考えました。灌流液を頻繁に交換したり、大量の灌流液を使用したりすると、理論的には、分解されたアデニンヌクレオチドが細胞から洗い流され、腎臓が再加温されたときにATPへの再合成に利用できなくなるという欠点があります。

核DNAは腎臓を冷蔵保存すると損傷を受ける。ラザルス^[89]は、低温保存したマウスの腎臓では16時間以内に一本鎖DNAの切断が起こることを示したが、コリンズ溶液やサックス溶液で保存すると損傷が少し抑制された。この核損傷は、二本鎖DNAの切断が起こる温保存時の損傷とは異なっていた。^[90]

灌流保存法は腎臓の血管内皮を機械的に損傷する可能性があり、再移植後に動脈血栓症やフィブリン沈着を引き起こす。Hill ^[63]は、ヒトの腎臓では、再移植後の糸球体におけるフィブリン沈着と術後機能が灌流保存の長さと相関していることを指摘した。彼は、灌流または氷保存で保存されたヒトの腎臓から血行再建時に生検を行い、電子顕微鏡検査によって、内皮破壊は灌流された腎臓でのみ発生したことを示した。血行再建から 1 時間後に採取した生検では、剥脱した血管基底膜の領域に血小板とフィブリンが付着していた。Sheil ^[91]は異なるタイプの血管損傷について説明し、腎動脈につながれたカニューレの遠位にジェット病変が生じ、カニューレ部位から約 1 cm 遠位で動脈血栓症を引き起こすことを示

灌流液に特異的抗体が含まれていた場合、再移植後に免疫学的メカニズムが低体温灌流腎臓を損傷する可能性があるという証拠がある。Cross ^{[92] は、}片方の対に対する型特異的 HLA 抗体を含む凍結沈降血漿を同時に灌流した 2 組のヒト死体腎臓について報告している。これらの腎臓は両方とも早期動脈血栓症を患った。Light ^[93]は灌流保存後の同様の超急性拒絶反応について報告し、使用した凍結沈降血漿に細胞傷害性 IgM 抗体が含まれていたことを示した。凍結沈降血漿を使用することのこの潜在的な危険性は、Filo ^[94]によって実験的に実証された。Filo は、特異的に感作した凍結沈降イヌ血漿でイヌ腎臓を 24 時間灌流し、毛細血管充血、内皮腫脹、多形核白血球の浸潤、動脈血栓症を伴う糸球体および血管病変を誘発できることを発見した。免疫蛍光顕微鏡検査により、IgG が内皮表面、糸球体、血管に特異的に結合することが示されました。再移植後、補体固定と組織損傷が同様のパターンで発生しました。組織学的損傷の重症度とその後の腎臓機能の間には、ある程度の相関関係がありました。

多くの研究者が再移植中に腎臓が再加温されるのを防ごうとしてきたが、能動冷却システムの使用について記述したのはコーエンだけである。^[59]冷却システム内外を問わず、模擬吻合を受けた腎臓からのリソソーム酵素放出の測定により、冷蔵保存期間後の腎臓の再加温に対する感受性が実証され、酵素放出防止における冷却システムの有効性が確認された。再移植手術での損傷を最小限に抑えるためのさらなる要因は、腎臓が冷却コイル内で 7 °C に保たれたことである可能性がある。これは、灌流保存中に使用された温度と 1 度以内であり、そのため腎臓は氷冷が使用された場合よりも大きな温度変化にさらされなかった。

デンプスター^[95]は、腎臓の損傷を避けるために、腎臓再移植手術の最後に血管クランプをゆっくりと緩めることを説明したが、他の研究者はこの手技を使用したかどうかについては言及していない。コーエンが3日間の灌流保存後に腎内出血を伴う血管損傷を発見した後、^[59]腎内血管が十分に緊張を回復し、脆弱な糸球体血管に完全な収縮期圧がかかるのを防ぐことを目的として、その後のすべての実験でゆっくりとした血行再建術が使用された。コーエンのその後の灌流で大きな血管損傷が見られなかったのは、この手技を使用したためである可能性がある。

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