イソペプチド結合

イソペプチド結合は、あるアミノ酸のカルボキシル基と別のアミノ酸のアミノ基の間に形成されるアミド結合の一種です。イソペプチド結合は、あるアミノ酸の側鎖アミノ基またはカルボキシル基と、別のアミノ酸のα-カルボキシル基、α-アミノ基、または側鎖との間の結合です。ユーペプチド結合としても知られる典型的なペプチド結合では、アミド結合は常に1つのアミノ酸のα-カルボキシル基と2番目のアミノ酸のα-アミノ基の間に形成されます。イソペプチド結合は通常のペプチド結合よりもまれです。^{[1]イソペプチド結合は、タンパク質の}一次配列の分岐につながります。通常のペプチド結合から形成されたタンパク質は、通常、線状の一次配列を持ちます。

アミド結合、そしてイソペプチド結合は、カルボニル酸素、カルボニル炭素、窒素原子間の共鳴（電子の非局在化）によって安定化される。イソペプチド結合の結合強度は、結合タイプが似ているため、ペプチドの結合強度と似ている。ペプチド結合の結合強度は約300 kJ/mol、つまり約70 kcal/molである。^[2]

リジン、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン酸、アスパラギンなどのアミノ酸は、すべて側鎖にアミノ基またはカルボキシル基を含んでいるため、イソペプチド結合を形成できます。たとえば、リジンとグルタミンの側鎖間のイソペプチド結合の形成は次のようになります。

• Gln−(C=O)NH ₂ + Lys-NH ₃ ⁺ → Gln−(C=O)NH−Lys + NH ₄ ⁺

リジンの ε-アミノ基は、次の反応のように他のアミノ酸の α-カルボキシル基とも反応します。

• イルス-(C=O)O ^- + リジン-NH ₃ ⁺ → イルス-(C=O)NH-リジン + H ₂ O

イソペプチド結合の形成は、典型的には酵素触媒される。^[3]上に示したように、リジンとグルタミンの反応は、トランスグルタミナーゼによって触媒される。酵素触媒によるイソペプチド結合形成の別の例は、グルタチオン分子の形成である。トリペプチドであるグルタチオンは、通常のペプチド結合（システインとグリシンの間）とイソペプチド結合（グルタミン酸とシステインの間）を含む。グルタミン酸のγ-カルボキシル基とシステインのα-アミノ基の間のイソペプチド結合の形成は、γ-グルタミルシステイン合成酵素によって触媒される。^[3]細胞内ペプチダーゼ^[3]はこの結合を認識できず、したがって結合を加水分解しないため、ユーペプチド結合の代わりにイソペプチド結合が形成される。イソペプチド結合は、バクテリオファージHK97カプシドの成熟で観察されるように、自発的に形成されることがある。^[4]この場合、リジンのε-アミノ基は、アスパラギンの側鎖カルボキサミド基と自己触媒的に反応する。^{[4]リジンとアスパラギンの間の自発的なイソペプチド結合形成は、}グラム陽性細菌の線毛でも起こる。^[5]

酵素によって生成されるイソペプチド結合には、シグナル伝達と構造という2 つの主な生物学的目的があります。

バイオシグナリングはタンパク質機能^[6]、クロマチン凝縮^[7]、タンパク質半減期^[8]に影響を及ぼします。イソペプチド結合の生体構造的役割には、血液凝固^[9] (創傷治癒のため)、細胞外マトリックスの維持^[10] 、アポトーシス経路^[10]、微小管の修正^[11]、細菌における病原性ピルの形成^[12]などがあります。イソペプチド結合はコレラ菌の病原性に寄与しており、アクチン架橋ドメイン (ACD) がアクチンのグルタミン酸の γ-カルボキシル基とリジンの ε-アミノ基の間に分子間結合を形成します。^{[13]このプロセスにより、}宿主細胞内でのアクチンの重合が停止します。^[13]

シグナル伝達を目的として1つのタンパク質を別のタンパク質に結びつけるイソペプチド結合については、文献ではユビキチンと他の類似タンパク質が主流となっている。ユビキチンとその関連タンパク質（SUMO、Atg8、Atg12など）はすべて、比較的同じタンパク質連結経路に従う傾向がある。^[6]

ユビキチンおよびユビキチン様タンパク質によるタンパク質連結のプロセスには、3つの主なステップがあります。^[6]最初のステップでは、特定の活性化タンパク質（E1またはE1様タンパク質）がATPでユビキチンをアデニル化して活性化します。^{[6]次に、アデニル化されたユビキチンは、ユビキチンの}C末端グリシンのカルボキシル基とE1システインの硫黄との間のチオエステル結合を使用して、保存されたシステインに転移できます。 ^{[6] [14] [15]}次に、活性化E1酵素はユビキチンと結合して次の層であるE2酵素に転移し、E2酵素はタンパク質を受け入れて、再び保存された結合でチオエステルを形成します。 E2はある程度の仲介者として機能し、最終段階ではE3酵素リガーゼに結合し、最終的にユビキチンまたはユビキチン関連タンパク質を標的タンパク質のリジン部位に転移させるか、より一般的にはユビキチン自体に転移させて、そのタンパク質の鎖を形成します。^[14]

しかし、最終段階では、E3リガーゼの種類によっては、実際には結合を引き起こしていない可能性があるという相違もあります。HECTドメインを含むE3リガーゼがあり、この「転送チェーン」を継続して、別の保存されたシステインを介してユビキチンを再度受け入れ、それを標的にして目的のターゲットに転送します。しかし、亜鉛イオンとの配位結合を使用して構造を安定化するRINGフィンガードメインを含む場合は、反応を誘導する働きが強くなります。つまり、RINGフィンガーE3リガーゼがユビキチンを含むE2に結合すると、それは単にE2をリジン部位で標的タンパク質に直接連結するように誘導する標的デバイスとして機能することを意味します。^{[14] [16]}

この場合、ユビキチンはそれに関連する他のタンパク質をよく表していますが、各タンパク質には明らかに独自の厄介な点があります。たとえば、SUMOはRINGフィンガードメインリガーゼである傾向があり、E3は単にE2によるライゲーションを指示する標的デバイスとして機能し、ユビキチンE3-HECTリガーゼのように実際に反応を実行するわけではありません。^[15]したがって、タンパク質が転移チェーンに参加する方法などの内部メカニズムは異なりますが、標的化にチオエステルや特定のリガーゼを使用するなどの一般的な化学的側面は同じままです。

構造目的のイソペプチドの形成に関与する酵素化学は、ユビキチンおよびユビキチン関連タンパク質の場合とは異なります。つまり、複数の酵素が基質を活性化、結合、標的化するという連続的なステップではなく、^[17]触媒は 1 つの酵素によって実行され、前駆ステップは、もしあるとすれば、通常は酵素前駆体から酵素を活性化するための切断のみです。しかし、ユビキチンの場合に存在する均一性は、ここではそうではなく、イソペプチド結合を形成する反応を実行するさまざまな酵素が多数存在します。

最初の例はソルターゼです。ソルターゼは、多数のグラム陽性細菌に広く分布する酵素ファミリーです。これは重要な病原性および毒性因子であることが示されています。ソルターゼによって実行される一般的な反応には、独自の「触媒トライアド」の使用が含まれます。つまり、反応メカニズムにヒスチジン、アルギニン、システインを使用します。ヒスチジンとアルギニンは反応環境の作成に役立ち、システインが再び反応中心として機能します。チオエステルを使用してカルボキシル基を保持し、リジンのアミンが求核攻撃を実行してタンパク質を転移し、イソペプチド結合を形成できるようにします。酵素反応で間接的ではありますが重要な役割を果たすイオンは、ソルターゼによって結合されるカルシウムです。カルシウムは、酵素の構造を触媒に最適な構造に保つ上で重要な役割を果たします。ただし、カルシウムが触媒作用の発生に必須ではないことが示されたケースもあります。^[18]

ソルターゼを一般的に区別するもう1つの側面は、ソルターゼが基質に対して非常に特異的な標的を持っていることです。ソルターゼには通常2つの機能があり、1つ目は細菌の細胞壁へのタンパク質の融合であり、2つ目はピリンの重合です。タンパク質を細胞壁に局在させるプロセスでは、タンパク質が疎水性ドメイン、正に帯電したテール領域、および認識に使用される最終的な特定の配列を含むという3つの要件があります。^[19]これらのシグナルの中で最もよく研​​究されているのはLPXTGで、これは切断点として機能し、ソルターゼはここでThrとGlyの間を攻撃し、Thrカルボキシル基と結合します。^[18]次に、チオエステルはペプチドを第一級アミンに転移することによって分解されますが、これは通常非常に高い特異性を持ち、B. cereusの例では、ソルターゼD酵素が2つの認識シグナルを介してBcpAタンパク質の重合を助けます。LPXTGは切断およびチオエステル形成点として、YPKN部位はイソペプチドが形成される認識シグナルとして機能します。^[20]詳細は細菌によって異なる場合がありますが、ソルターゼ酵素化学の基本は同じです。

次の例はトランスグルタミナーゼ（TGase）で、これは主に真核生物内で、創傷治癒や脂質膜へのタンパク質の付着など、さまざまな理由で異なるタンパク質を融合する働きをします。^{[21] [22]} TGase自体にも、ヒスチジン、アスパラギン酸、システインからなる独自の「触媒トライアド」が含まれています。これらの残基の役割は、前述のソルターゼと類似または同じであり、ヒスチジンとアスパラギン酸は標的残基との相互作用において補助的な役割を果たし、システインがカルボキシル基とチオエステルを形成して、この場合はリジンの興味により、その後の第一級アミンによる求核攻撃に備えます。ただし、ソルターゼとの触媒的な類似点はそこで終わります。酵素とファミリーはカルシウムに依存しており、カルシウムは酵素の堅固な構造を保持する上で重要な構造的役割を果たしているからです。 TGasesはまた、Gln-Gln-Val配列の中央のGlnを特異的に標的とする点で、非常に異なる基質特異性を持っています。一般的な基質特異性、つまり特定のタンパク質は、基質を標的とするさまざまなTGasesの一般的な構造によるものです。^[23]

TGasesには特異性があることが分かっており、異なるTGasesは同じタンパク質上の異なるGlnと反応し、酵素が非常に特異的な初期標的を持っていることを示しています。^[24]また、タンパク質をどの標的リジンに転移するかについても、ある程度の特異性があることが示されています。例えば、第XIII因子の場合、リジンに隣接する残基によって反応が起こるかどうかが決まります。^[22]そのため、TGasesは最初は真核生物のソルターゼのように見えるかもしれませんが、独立した酵素セットとして存在します。

構造上の目的でイソペプチドを結合する酵素の別の例は、コレラ菌によって生成される MARTX 毒素タンパク質のアクチン架橋ドメイン (ACD) です。ACD は触媒作用を行う際に架橋の形成にマグネシウムと ATP を使用することが示されていますが、そのメカニズムの詳細は不明です。この場合に形成される架橋の興味深い点は、非末端 Glu を使用して非末端 Lys に結合していることですが、これはイソペプチド結合を形成するプロセスではまれなようです。^[25] ACD の化学的性質はまだ解明されていませんが、タンパク質間の非末端イソペプチド結合の形成は Asp/Asn だけに依存しているわけではないことを示しています。

最後に検討するケースは、興味深いミクロチューブリン（MT）の翻訳後修飾のケースです。MTにはさまざまな翻訳後修飾が含まれますが、最も注目されているのはポリグルタミル化とポリグリシル化の2つです。両方の修飾は、MTのC末端領域にあるグルタミン酸の側鎖カルボキシル基に融合した同じアミノ酸の繰り返しストレッチであるという点で似ています。ポリグリケーション酵素についてはあまり知られていないため、酵素メカニズムは完全には解明されていません。ポリグルタミル化の場合も正確なメカニズムは不明ですが、ATPに依存しているようです。^[26]酵素化学に関しては依然として明確さが欠けていますが、グルタミン酸のR基カルボキシルと修飾ペプチドのN末端アミノを組み合わせてイソペプチド結合を形成するという貴重な洞察がまだあります。

自発的なイソペプチド結合形成は、 SpyTagと呼ばれるペプチドタグの開発に利用されています。SpyTagは、共有イソペプチド結合を介して、結合パートナー（SpyCatcherと呼ばれるタンパク質）と自発的かつ不可逆的に反応することができます。^{[27]この分子ツールは、}生体内タンパク質標的化、蛍光顕微鏡、およびタンパク質マイクロアレイの不可逆的な付着に応用できる可能性があります。これに続いて、SpyTag/SpyCatcherを補完するSnoopTag/SnoopCatcher ^[28]やSdyTag/SdyCatcher ^[29]などの他のタグ/キャッチャーシステムが開発されました。

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