比色分析

物理化学および分析化学において、比色分析は溶液中の着色化合物またはイオンの濃度を決定する方法です。^[¹^]有機化合物、無機化合物、およびイオンに適用できます。多くの場合、分析は、分析対象物と反応して着色生成物を生成する試薬を使用して完了します。酵素段階が必要な場合もあります。この方法は、医療検査室や産業目的、例えば工業用水処理に関連した水サンプルの分析などで広く使用されています。

比色計は、特定の波長の光における溶液の吸光度を測定する装置です（一般的に色を測定するために使用される三刺激比色計と混同しないでください）。比色計を使用するには、既知の濃度のコントロールまたは参照を含むさまざまな溶液を作成する必要があります。たとえば、図示されているデュボスク比色計のような視覚比色計では、溶液を通過する光路の長さを変化させながら、フィルターを通した光を視覚的に比較して一致させることができます。色が一致するときに濃度と光路の長さが等しいとみなされるため、未知物質の濃度は単純な比例によって決定できます。^[²^]ネスラー管は同じ原理で動作します。

電子式自動比色計もあります。これらの機器を使用する前に、コントロール溶液の入ったキュベットで校正する必要があります。サンプルの濃度は、ベール・ランバートの法則を用いて、サンプルを通過する前後の光強度から計算できます。光電式分析計は1960年代に主流となりました。比色計に選択するフィルターの色または波長は非常に重要です。比色計が透過する光の波長は、測定対象物質が吸収する波長と同じでなければならないからです。たとえば、液体が青色の場合、比色計のフィルターは赤色に設定されることがあります。

装置

必要な機器は、比色計、キュベット、および適切な発色試薬です。プロセスは、例えば自動分析装置の使用やフローインジェクション分析によって自動化できます。最近では、比色計用に開発された比色分析法が、分析の迅速化と廃棄物の削減のためにプレートリーダーでの使用に適応されています。 ^{[ 3 ]}

比色分析法

比色分析法では、分析対象物の存在下で測定可能な色の変化を起こす試薬を使用します。生化学では、酵素、特定の化合物、抗体、ホルモン、その他多くの分析対象物の存在を検査するために広く使用されています。例えば、

パラニトロフェニルリン酸は、アルカリホスファターゼ酵素によって黄色の生成物に変換される。
クマシーブルーは芳香族色素であり、芳香族タンパク質およびタンパク質構造内の正に帯電したアミノ酸残基に結合します。^{[ 4 ]}この結合相互作用によりスペクトルシフトが生じ、タンパク質濃度を定量的に測定することが可能になります。同様の比色分析法であるビシンコニン酸アッセイは、化学反応を利用してタンパク質濃度を決定します。
ビウレットアッセイは、アルカリ溶液中で銅塩がキレート化することによりタンパク質の存在下で紫色に変化するビウレット試薬を使用する。^{[ 5 ]}
酵素結合免疫測定法は、酵素と複合体を形成した抗体を用いて抗原を検出する。抗体の結合は、TMBなどの試薬の色の変化から推測されることが多い。

非酵素的方法

例

カルシウム

カルシウム+ o-クレゾールフタレインコンプレキソン → 有色錯体^{[ 6 ]}

銅

銅+ バソクプロインジスルホン酸塩 → 有色錯体^{[ 7 ]}

クレアチニン

クレアチニン+ピクリン酸→ 有色複合体^{[ 8 ]}

鉄

鉄+ バソフェナントロリンジスルホン酸塩 → 有色錯体^{[ 9 ]}

リン酸塩（無機物）

リン酸塩+モリブデン酸アンモニウム+アスコルビン酸→ 青色の錯体^{[ 10 ]}

酵素法

酵素分析（医療検査室で広く用いられている）では、発色反応に先立って酵素触媒反応が起こります。酵素は特定の基質に特異的であるため、より正確な結果が得られます。酵素分析は、酵素が最適に作用する条件を整えるため、常に緩衝溶液中で一定温度（通常37℃）で行われます。以下に例を示します。

例

コレステロール（CHOD-PAP法）

コレステロール+酸素→ (酵素コレステロールオキシダーゼ) → コレステノン +過酸化水素
過酸化水素 + 4-アミノフェナゾン+フェノール--(酵素ペルオキシダーゼ)--> 有色錯体 + 水^{[ 11 ]}

グルコース（GOD-Perid法）

グルコース+ 酸素 +水--(酵素グルコースオキシダーゼ)-->グルコン酸+ 過酸化水素
過酸化水素 + ABTS --(酵素ペルオキシダーゼ)--> 有色複合体^{[ 12 ]}

この場合、反応の両段階は酵素によって触媒される。

トリグリセリド（GPO-PAP法）

トリグリセリド+ 水 → (酵素エステラーゼ) →グリセロール+カルボン酸
グリセロール + ATP → (酵素グリセロールキナーゼ) →グリセロール-3-リン酸+ ADP
グリセロール-3-リン酸 + 酸素 --(酵素グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ) --> ジヒドロキシアセトンリン酸 + 過酸化水素
過酸化水素 + 4-アミノフェナゾン+ 4-クロロフェノール--(酵素ペルオキシダーゼ)--> 有色錯体^{[ 13 ]}

尿素

尿素+ 水 → (ウレアーゼ酵素) →炭酸アンモニウム
炭酸アンモニウム +フェノール+次亜塩素酸塩----> 有色錯体^{[ 14 ]}

この場合、反応の第一段階のみが酵素によって触媒される。第二段階は非酵素的である。

略語

CHOD = コレステロール酸化酵素
GOD = グルコースオキシダーゼ
GPO = グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ
PAP = フェノール + アミノフェナゾン（一部の方法では、フェノールは毒性の低い4-クロロフェノールに置き換えられる）
POD = ペルオキシダーゼ

紫外線法

紫外線（UV）法では目に見える色の変化はありませんが、原理は全く同じで、溶液の吸光度の変化を測定します。UV法では通常、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD）とその還元型（NADH）の340 nm波長における吸光度の差を測定します。

例

ピルビン酸

ピルビン酸+ NADH --(酵素乳酸脱水素酵素)--> L-乳酸+ NAD ^{[ 15 ]}

参考文献

↑ Housecroft, Catherine; Constable, Edwin (2006). Chemistry: an introduction to organic, inorganic, and physical chemistry . Pearson Education. pp. 349–353 . ISBN 978-0-13-127567-6。
↑ルイス・ローゼンフェルド（1999）。臨床化学の四世紀。CRC Press。pp. 255–258。ISBN 978-90-5699-645-1。
↑ Greenan, NS、RL Mulvaney、および GK Sims。1995年。「土壌抽出物中の尿素の比色定量のためのマイクロスケール法」。Commun . Soil Sci. Plant Anal. 26:2519-2529。
↑ Astrof , Nathan S.; Horowitz, Gail (2018年7月10日). 「意図的な不一致と歴史的物語を取り入れたタンパク質比色実験」. Journal of Chemical Education . 95 (7): 1198–1204 . Bibcode : 2018JChEd..95.1198A . doi : 10.1021/acs.jchemed.7b00633 .
↑ Bianchi-Bosisio, A. (2005). "PROTEINS | Physiological Samples". Encyclopedia of Analytical Science . pp. 357–375 . doi : 10.1016/B0-12-369397-7/00494-5 . ISBN 978-0-12-369397-6。
↑レイ・サルカールとチョーハン (1967) Anal. Biochem. 20:155
↑ザック、B. (1958) Clin.チム。アクタ。 3:328
↑ホーク、オーサー、サマーソン著『実践生理化学』、チャーチル出版、ロンドン、1947年、839-844ページ
↑参考文献は後ほど
↑ Heidari-Bafroui, Hojat; Ribeiro, Brenno; Charbaji, Amer; Anagnostopoulos, Constantine; Faghri, Mohammad (2020-10-16). "紙ベースのリン酸塩検出装置の検出限界を向上させるためのポータブル赤外線ライトボックス" . Measurement . 173 108607. doi : 10.1016/j.measurement.2020.108607 . ISSN 0263-2241 . S2CID 225140011 .
↑参考文献は後ほど
↑レイとヴィーリンガー (1970) Z. 分析。化学。 252:224
↑参考文献は後ほど
↑ファウセットとスコット（1960） J. Clin. Pathol. 13:156
↑参考文献は後ほど

[1] Housecroft, Catherine; Constable, Edwin (2006). Chemistry: an introduction to organic, inorganic, and physical chemistry . Pearson Education. pp. 349–353 . ISBN 978-0-13-127567-6。

[2] ルイス・ローゼンフェルド（1999）。臨床化学の四世紀。CRC Press。pp. 255–258。ISBN 978-90-5699-645-1。

[3] Greenan, NS、RL Mulvaney、および GK Sims。1995年。「土壌抽出物中の尿素の比色定量のためのマイクロスケール法」。Commun . Soil Sci. Plant Anal. 26:2519-2529。

[4] Astrof , Nathan S.; Horowitz, Gail (2018年7月10日). 「意図的な不一致と歴史的物語を取り入れたタンパク質比色実験」. Journal of Chemical Education . 95 (7): 1198–1204 . Bibcode : 2018JChEd..95.1198A . doi : 10.1021/acs.jchemed.7b00633 .

[5] Bianchi-Bosisio, A. (2005). "PROTEINS | Physiological Samples". Encyclopedia of Analytical Science . pp. 357–375 . doi : 10.1016/B0-12-369397-7/00494-5 . ISBN 978-0-12-369397-6。

[6] レイ・サルカールとチョーハン (1967) Anal. Biochem. 20:155

[7] ザック、B. (1958) Clin.チム。アクタ。 3:328

[8] ホーク、オーサー、サマーソン著『実践生理化学』、チャーチル出版、ロンドン、1947年、839-844ページ

[9] 参考文献は後ほど

[10] Heidari-Bafroui, Hojat; Ribeiro, Brenno; Charbaji, Amer; Anagnostopoulos, Constantine; Faghri, Mohammad (2020-10-16). "紙ベースのリン酸塩検出装置の検出限界を向上させるためのポータブル赤外線ライトボックス" . Measurement . 173 108607. doi : 10.1016/j.measurement.2020.108607 . ISSN 0263-2241 . S2CID 225140011 .

[11] 参考文献は後ほど

[12] レイとヴィーリンガー (1970) Z. 分析。化学。 252:224

[13] 参考文献は後ほど

[14] ファウセットとスコット（1960） J. Clin. Pathol. 13:156

[15] 参考文献は後ほど

[

[

[ 3 ]

[ 4 ]

[ 5 ]

[ 6 ]

[ 7 ]

[ 8 ]

[ 9 ]

[ 10 ]

[ 11 ]

[ 12 ]

[ 13 ]

[ 14 ]

[ 15 ]