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ビシンコニニック酸アッセイ（BCAアッセイ）は、ピアスケミカルカンパニー（現在はサーモフィッシャーサイエンティフィック傘下） [1]のポール・K・スミス氏にちなんでスミスアッセイとも呼ばれ、溶液中のタンパク質の総濃度（0.5μg/mL～1.5mg/mL）を測定する生化学アッセイで、ローリータンパク質アッセイ、ブラッドフォードタンパク質アッセイ、ビウレット試薬に似ています。総タンパク質濃度は、タンパク質濃度に比例してサンプル溶液の色が青から紫に変化することで示され、比色法で測定できます。BCAアッセイはピアスケミカルカンパニーによって1989年に特許取得され、2006年に特許が失効しました。[2]
機構
BCA ストック溶液には、pH 11.25の高アルカリ性溶液に、ビシンコニン酸、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、硫酸銅 (II)五水和物などの成分が含まれています。
BCA アッセイは主に 2 つの反応に依存しています。まず、タンパク質のペプチド結合により、硫酸銅 (II) のCu 2+イオンが Cu 1+に還元されます(温度依存反応)。還元される Cu 2+の量は、溶液中に存在するタンパク質の量に比例します。次に、ビシンコニン酸の 2 つの分子が各 Cu 1+ イオンとキレート化し、波長562 nmの光を強く吸収する紫色の錯体を形成します。
ビシンコニン酸Cu 1+複合体は、タンパク質サンプル中のシステイン/シスチン、チロシン、トリプトファン側鎖の存在によって影響を受けます。高温（37～60℃）では、ペプチド結合が反応複合体の形成を助けます。BCAアッセイを高温でインキュベートすることは、不均一なアミノ酸組成によって引き起こされる変動を最小限に抑えながらアッセイ感度を高める方法として推奨されます。[3]
溶液中に存在するタンパク質の量は、吸収スペクトルを測定し、既知の濃度のタンパク質溶液と比較することによって定量化できます。
制限事項
BCAアッセイは還元剤や金属キレート剤とはほとんど互換性がありませんが、微量であれば許容される可能性があります。[4] BCAアッセイは一般的な膜脂質やリン脂質にも反応すると報告されています。[5]
アッセイのバリエーション
BCA アッセイにはいくつかの代替バリエーションがあります。
オリジナルBCAアッセイ
スミス氏によると、[1]オリジナルの BCA アッセイは 2 成分プロトコルです。2 つの試薬は「室温で無期限に安定」しています。[1]最新の (おそらくまったく同じか非常に類似した) 処方は、少なくとも 2 つの商用ベンダーから入手できます。[6] [7] BCA 作業溶液は、試薬 A と試薬 B を 50:1 の比率で混合して生成され、毎週 (中程度に安定) または必要に応じて準備できます。
試薬A [1]
- 1% w/v BCA-Na 2 (CAS: 979-88-4)
- 2% w/v Na 2 CO 3・H 2 O (CAS: 5968-11-6)
- 0.16% w/v酒石酸Na 2 (CAS: 868-18-8)
- 0.4% w/v NaOH (CAS: 1310-73-2)
- 0.95% w/v NaHCO 3 (CAS: 144-55-8)
- 50% NaOHまたは固体NaHCO 3を加えてpHを11.25に調整します。
スミスの原稿で提案されているがテストされていない代替処方は、NaOHを省略し（おそらく手動でpHを11.25に調整しない）、代わりに0.25 M Na 2 CO 3と0.01 M NaHCO 3の調製済み緩衝液に他の成分を溶解するというものである。[1]
注目すべきことに、スミスはイサチンとアセトインのフィッツィンガー反応によって独自のBCAを合成しました。KOHの代わりにNaOHを使用しましたが、それ以外はレセンとヘンツェの合成法に従っていました[8]。当時市販されていたBCAは不純すぎて使用できなかったためです。合成したBCAを分析に十分な純度にするには、70℃の水から少なくとも3回連続して再結晶する必要がありました[1] 。
試薬B [1]
- 4% w/v CuSO 4 ·5H 2 O
マイクロ BCA アッセイ (希薄溶液用)
BCA マイクロ BCA アッセイは、ビウレット反応、BCA、銅 (II)試薬の濃縮ストックを使用する 3 成分プロトコルです。これにより、元の BCA アッセイの 20 - 2000 μg/mL に対して、約 2 - 40 μg/mL に感度が向上します。ただし、非タンパク質成分からの干渉は異なり、一般的に言えば、より敏感です。[4]マイクロ BCA アッセイのキットは、少なくとも 2 つの商用ベンダーから入手できます。[9] [10]特に、「マイクロ BCA 試薬とプロトコル」の構成と使用法は、Smith による元の原稿で説明されており、[1]現代のキットは、まったく同じか非常によく似た配合で構成されている可能性があります。プロトコルは、マイクロ試薬 B と銅溶液を 25:1 で混合してマイクロ試薬 C (MC) を作成します。これは保存安定性がないため、新しく調製する必要があります。次に、MC をマイクロ試薬 A と 1:1 で混合して、最終的な (これも不安定な) アッセイ作業溶液を作成します。マイクロ試薬 A、マイクロ試薬 B、および銅溶液は、室温で無期限に安定しています。[1]
マイクロ試薬A（MA）[1]
- 8% w/v Na 2 CO 3・H 2 O (CAS: 5968-11-6)
- 1.6% w/v NaOH (CAS: 1310-73-2)
- 1.6 % w/v酒石酸ナトリウム(CAS: 868-18-8) (上記オリジナル BCA アッセイの試薬 A の 10 倍濃度)
- pHを11.25に調整するのに十分なNaHCO 3（CAS：144-55-8）
マイクロ試薬B（MB）[1]
- 4% w/v BCA-Na 2 (CAS: 979-88-4) (上記オリジナルBCAアッセイの試薬Aの4倍の濃度)
銅溶液[1]
- 4% w/v CuSO 4 ·5H 2 O (CAS: 7758-99-8) (上記のオリジナルBCAアッセイの試薬Bと同じ濃度)
還元剤適合性（RAC）BSAアッセイ
このタイプのBCAアッセイには、独自のチオール共有結合ブロッキング「適合性試薬」[11]、別名還元剤適合性試薬（RACA）[12]が含まれています。これにより還元剤との適合性が向上しますが、アッセイは他の非タンパク質成分とは異なる干渉プロファイルを持っています。[4]
ラピッドゴールドBCA
このタイプの BCA アッセイは、サーモフィッシャーサイエンティフィックからのみ入手可能のようです。伝えられるところによると、このアッセイは「独自の [特許取得済み] 銅キレート剤を使用した従来の BCA タンパク質アッセイと同じ銅還元法」を使用しており、562 nm ではなく 480 nm で吸収します。[13]この特許取得済みキレート剤と、最適化されたビウレット反応処方により、このアッセイは、元の BCA アッセイの 37˚C 以上のインキュベーションなしで、迅速に (<5 分) 結果を得ることができます。ただし、このアッセイは、他の非タンパク質成分とは異なる干渉プロファイルを持っています。[ 4] Pierce定量比色ペプチドアッセイ (現在はサーモフィッシャーサイエンティフィックが所有し、同社から入手可能) は、類似または同一の 480 nm 吸収特許取得済み銅キレート剤を使用しているようです。[14]
参照
参考文献
- ^ abcdefghijkl Smith, PK; et al. (1985). 「ビシンコニン酸を用いたタンパク質の測定」. Anal. Biochem . 150 (1): 76–85. doi :10.1016/0003-2697(85)90442-7. PMID 3843705.
- ^ 「US4839295A - ビシンコニン酸を使用したタンパク質の測定」。Google Patents . 1987-05-26 . 2023-04-09に閲覧。
- ^ Olsen BJ、Markwell J (2007)。「タンパク質濃度測定のためのアッセイ」(PDF)。タンパク質科学の最新プロトコル: 14–17。
- ^ abcd Fisher Scientific、Thermo。「タンパク質定量アッセイ適合性表」（PDF） 。 2023年4月19日閲覧。
- ^ Kessler, Ralph J.; Fanestil, Darrell D. (1986). 「ビシンコニン酸を用いたタンパク質測定における脂質による干渉」.分析生化学. 159 (1). Elsevier BV: 138–142. doi :10.1016/0003-2697(86)90318-0. ISSN 0003-2697. PMID 3812993.
- ^ Fisher Scientific、Thermo。「Pierce BCA タンパク質アッセイキット - ユーザーマニュアル」（PDF） 。 2023年4月22日閲覧。
- ^ Biosciences, G-. 「ビシンコニン酸（BCA）タンパク質アッセイ - ユーザーマニュアル」（PDF） 。 2023年4月22日閲覧。
- ^ Lesesne、シャーマン D.;ヘンツェ、ヘンリー R. (1942)。 「プフィツィンガー反応によるキノリンの合成におけるアルコキシケトンの利用。II1」。アメリカ化学会誌。64（8）。アメリカ化学会 (ACS): 1897 ～ 1900 年。土井：10.1021/ja01260a041。ISSN 0002-7863。
- ^ Fisher Scientific、Thermo。「Micro BCA Protein Assay Kit - 説明書」（PDF）。2023年4月22日閲覧。
- ^ Biosciences、G-.「マイクロビシンコニン酸（BCA）タンパク質アッセイ - ユーザーマニュアル」（PDF）。
- ^ Fisher Scientific、Thermo。「Pierce Microplate BCA-RAC Protein Assay Kit - ユーザーマニュアル」（PDF） 。 2023年4月22日閲覧。
- ^ Biosciences, G-. 「ビシンコニン酸（BCA）還元剤適合タンパク質アッセイ - ユーザーマニュアル」（PDF） 。 2023年4月22日閲覧。
- ^ Fisher Scientific、Thermo。「Pierce Rapid Gold BCA タンパク質アッセイキット - ユーザーガイド」（PDF） 。 2023年4月22日閲覧。
- ^ Fisher Scientific、Thermo。「Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay - ユーザーマニュアル」（PDF）。Thermo Fisher Scientific 。 2023年7月19日閲覧。
- Wiechelman, K.; Braun, R. & Fitzpatrick, J. (1988). 「ビシンコニン酸タンパク質アッセイの調査: 色形成に関与するグループの特定」. Anal. Biochem . 175 (1): 231–7. doi :10.1016/0003-2697(88)90383-1. PMID 3245570.
- Stoscheck, CM. (1990). "6".タンパク質の定量. 酵素学の方法. 第182巻. pp. 50–69. doi :10.1016/0076-6879(90)82008-P. ISBN 9780121820831. PMID 2314256。
外部リンク
- オープンウェットウェア
- BCAアッセイ化学