ChIP-エキソ

ChIP-exo は、クロマチン免疫沈降法をベースにした手法で、目的のタンパク質 (転写因子) がゲノムに結合する位置をマッピングします。これはChIP-seqプロトコルの改良版で、結合部位の解像度が数百塩基対からほぼ 1 塩基対に向上しています。エキソヌクレアーゼを使用して、タンパク質結合部位から少数のヌクレオチドまで、5'-3' 方向のタンパク質結合 DNA 鎖を分解します。エキソヌクレアーゼ処理された末端のヌクレオチドは、DNA シーケンシング、マイクロアレイ、PCRを組み合わせて決定されます。これらの配列はゲノムにマッピングされ、タンパク質が結合するゲノム上の位置が特定されます。

クロマチン免疫沈降（ChIP ）技術は、タンパク質-DNA相互作用を検出するために1984年から使用されています^{[1] 。結果の質を向上させるために、ChIPには多くのバリエーションがあります。そのような改善の1つである}ChIP-on-chip（ChIP-chip）は、ChIPとマイクロアレイ技術を組み合わせたものです。この技術は感度と特異性が限られており、特にマイクロアレイが核区画に存在する何千ものタンパク質によって制限される生体内では、偽陽性率が高くなります。 ^[2]次に登場したのは、ChIPとハイスループットシーケンシングを組み合わせたChIP-sequencing （ChIP-seq）です。 ^[3]しかし、剪断されたDNA断片の不均一な性質により、結合部位が±300塩基対以内にマッピングされ、特異性が制限されます。第二に、DNAの混入は重大な問題を引き起こします。なぜなら、目的のタンパク質にクロスリンクされている遺伝子座が非常に少ないため、非特異的なゲノムDNAがバックグラウンドノイズの大きな原因となるからです。^[4]

これらの問題に対処するため、Rhee と Pugh は古典的なヌクレアーゼ保護アッセイを改訂し、ChIP-exo を開発しました。^[5]この新しい ChIP 技術は、5'-3' 方向の結合していない二本鎖 DNA のみを分解するラムダエキソヌクレアーゼに依存しています。簡単に言うと、目的のタンパク質 (エピトープタグで操作すると免疫沈降に便利です) は、ホルムアルデヒドを使用して、ゲノム全体の自然な結合位置に生体内で架橋されます。

次に細胞を収集し、破壊し、超音波処理によってクロマチンを切断して可溶化します。次に抗体を使用して、目的のタンパク質を架橋 DNA とともに免疫沈降させます。次に、DNA PCR アダプターを末端にライゲーションします。これは、エキソヌクレアーゼ消化後の 2 本鎖 DNA 合成のプライミング ポイントとして機能します。次に、ラムダ エキソヌクレアーゼが 5 ' 末端から二重 DNA 鎖を消化し、タンパク質と DNA の共有結合の境界で消化がブロックされるまで続けます。ほとんどの混入 DNA は、2 番目の一本鎖特異的エキソヌクレアーゼの添加によって分解されます。架橋が元に戻った後、PCR アダプターへのプライマーが伸長して二重鎖 DNA が形成され、2 番目のアダプターが 5 ' 末端にライゲーションされて、エキソヌクレアーゼ消化停止の正確な位置が区別されます。次に、ライブラリはPCRによって増幅され、産物はハイスループットシーケンシングによって識別されます。この方法では、ゲノム内の任意のタンパク質結合部位の最大1塩基対の解像度が可能になり、これはChIP-chipやChIP-seqよりもはるかに高い解像度です。

ChIP-exoは、タンパク質結合部位の特定において、最大1塩基対の解像度が得られることが示されています。これは、タンパク質の結合部位を±300塩基対までしか特定できないChIP-seqとは対照的です。^[4]

タンパク質に結合していないDNA断片の混入は、ChIP実験において偽陽性や偽陰性の発生率を高める可能性があります。プロセスにエキソヌクレアーゼを加えると、結合部位の呼び出しの解像度が向上するだけでなく、シーケンス前に溶液から混入DNAが除去されます。^[4]

ヌクレオチド断片に非効率的に結合したタンパク質は、ChIP-exoによって検出される可能性が高くなります。これにより、例えば、これまで発見されていたよりも多くのCTCF転写因子結合部位を認識できるようになりました。^[5]

解像度が高くバックグラウンドが低減されるため、ChIP-exoを使用する場合はシーケンスカバレッジの深度が少なくて済みます。^[4]

タンパク質-DNA複合体が単一の結合イベント内で複数の架橋部位を持つ場合、複数の異なる結合イベントがあるように見えることがあります。これは、これらのタンパク質が同じイベント内の利用可能な結合部位の1つで変性し、架橋することによって発生する可能性があります。その後、エキソヌクレアーゼは、タンパク質がどの部位に架橋されているかに応じて、結合部位の1つで停止します。^[5]

他の ChIP ベースの方法と同様に、この技術を使用するには、対象のタンパク質に適した抗体が利用可能である必要があります。

Rhee と Pugh は、酵母の Reb1、Gal4、Phd1、Rap1、ヒトの CTCF という転写因子の小さなコレクションの解析を行うことで、ChIP-exo を導入しました。Reb1 サイトはクラスターで見つかることが多く、これらのクラスターの占有率は予想よりも約 10 倍高くなっていました。クラスター内の二次サイトは、一次結合サイトから約 40 bp のところに見つかりました。Gal4 の結合モチーフは、4 つのヌクレオチドのうち 3 つに対して強い優先性を示し、Gal4 と除外されたヌクレオチドの間に負の相互作用があることを示唆しています。Phd1 は 3 つの異なるモチーフを認識し、これが Phd1 の結合モチーフの曖昧さに関する以前の報告を説明しています。Rap1 は 4 つのモチーフを認識することがわかりました。

このタンパク質が結合するリボソームタンパク質遺伝子は、より強いコンセンサス配列を持つ特定のモチーフを使用する傾向がありました。他の遺伝子は、おそらく同様の占有率を達成するために、より弱いコンセンサスモチーフのクラスターを使用することがよくありました。CTCF の結合モチーフは 4 つの「モジュール」を採用しました。結合した CTCF 部位の半分はモジュール 1 と 2 を使用し、残りは 4 つの組み合わせを使用しました。CTCF はジンクフィンガーを使用して、これらのモジュールのさまざまな組み合わせを認識すると考えられています。^[5]

RheeとPughは、サッカロミセスゲノムにおける前開始複合体（PIC）の構造と組織を分析した。ChIP-exoを使用することで、彼らは他の発見の中でも、TATAがないと報告されているプロモーターにおけるTATAのような特徴を正確に特定することができた。^[6]

• クロマチン免疫沈降
• ChIPシーケンス
• ChIPオンチップ
• タンパク質-DNA相互作用

• 高解像度の DNA-タンパク質相互作用
• 転写因子の結合を解明する
• 高解像度クロマチン免疫沈降
• 新たな手法で重要な遺伝子調節タンパク質を特定
• CexoR: ChIP-exo 複製における高解像度のタンパク質-DNA 相互作用を明らかにする R/Bioconductor パッケージ
• ペコニック・ゲノミクス