DRIP-seq

DRIP-seq（DRIPシーケンス）は、「 Rループ」と呼ばれるタイプのDNA-RNAハイブリッドのゲノムワイドなプロファイリングのための技術です。 ^{[ 1 ]} DRIP-seqは、DNA-RNA免疫沈降（DRIP）用の配列非依存的だが構造特異的な抗体を使用してRループを捕捉し、大規模並列DNAシーケンスを行います。^{[ 1 ]}

Rループは、DNA-RNAハイブリッド二重らせんと置換された一本鎖DNA（ssDNA）からなる3本鎖核酸構造である。 ^{[ 2 ]} Rループは主に転写中にシトシンに富むゲノム領域で形成され^{[ 2 ]} 、遺伝子発現や免疫グロブリンクラススイッチングに関与することが知られている。^{[ 1 ] [ 3 ] [ 4 ]}細菌から哺乳類まで、さまざまな種で発見されている。^{[ 2 ]}ヒト細胞ではCpGアイランドプロモーターに、酵母では転写が盛んな領域に優先的に局在する。 ^{[ 1 ] [ 3 ]}

異常な条件下、すなわち DNA-RNA ハイブリッドの産生が増加すると、R ループは、AIDやAPOBECなどの酵素の作用によって引き起こされる内因性損傷、または化学的に反応性の高い種への過剰曝露に一本鎖 DNA をさらすことで、ゲノム不安定性を引き起こす可能性があります。 ^{[ 4 ]}したがって、ゲノム全体で R ループがどこでどのような状況で形成されるかを理解することは、ゲノム不安定性をよりよく理解するために重要です。R ループの特性評価は、当初は遺伝子座特異的なアプローチに限られていました。^{[ 5 ]}しかし、大規模並列シーケンス技術とその後の DRIP-seq などの派生技術の登場により、ゲノム全体で R ループを調査する可能性が開かれました。

DRIP-seq は、さまざまな長さの DNA-RNA ハイブリッドに対するS9.6モノクローナル抗体(mAb)の高い特異性と親和性に依存しています。S9.6 mAb は 1986 年に初めて作成され特性が明らかにされ、現在では R ループの選択的免疫沈降に使用されています。 ^{[ 6 ]}それ以来、R ループの特性評価のためのさまざまな免疫沈降法で使用されています。^{[ 1 ] [ 3 ] [ 7 ] [ 8 ]} DRIP-seq の背後にある概念はChIP シーケンスに似ています。R ループ断片は、DRIP-seq で免疫沈降される主な材料です。

DRIP-seqは主にゲノムワイドなRループのマッピングに使用されます。Rループ形成部位を特定することで、特定の領域におけるRループ形成の機能、これらの領域の特徴、遺伝子発現への影響など、多様な細胞イベントの研究が可能になります。また、DNA複製や合成などの他のプロセスにおけるRループの影響を研究するためにも使用できます。間接的に、DRIP-seqはRループ解消に関与する遺伝子が欠損した変異細胞株で実行できます。^{[ 3 ]}これらのタイプの研究は、DNA-RNA形成の抑制における変異遺伝子の役割、そしてゲノム不安定性におけるRループの重要性についての情報を提供します。

DRIP-seqは、ヒトのRループのゲノムワイドなプロファイリングに初めて使用され、CpGアイランドプロモーターにRループが広く形成されていることが示されました。^{[ 1 ]}特に、研究者らは、Rループの形成がCpGアイランドの非メチル化状態と関連していることを発見しました。

DRIP-seqは後にヒト多能性Ntera2細胞の転写開始部位と終結部位におけるRループ形成のプロファイル作成に使用された。^{[ 7 ]}この研究では、遺伝子の3'末端のRループが転写終結と相関している可能性があることが研究者によって明らかにされた。

Rループ形成部位を検出するために、まずDRIP-seqから得られた数億のシーケンスリードをショートリードシーケンスアライナーで参照ゲノムにアライメントし、次にChIP-seq用に設計されたピークコール法を使用してDRIPシグナルを評価できます。^{[ 1 ]}同じサンプルの異なるDRIP-seq実験で異なる制限酵素カクテルが使用された場合、コンセンサスDRIP-seqピークがコールされます。^{[ 7 ]}通常、ピークは入力コントロールとして機能する対応するRNase H1処理サンプルからのピークと比較されます。 ^{[ 1 ] [ 7 ]}

RループおよびDRIP-seqデータセットの予測、注釈付け、可視化、および統合分析のために、QmRLFS-finder、DROPA、R-loopBase、およびRLBaseを含むいくつかの計算ツール、データベース、および分析フレームワークが開発されています。^{[ 9 ] [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ]}

Rループ免疫沈降のための抗体ベースの手法が他に存在しないため、DRIP-seqの結果の検証は困難である。しかし、DRIVE-seqなどの他のRループプロファイリング手法の結果を用いてコンセンサスを測定することは可能である。

一方、DRIP-seqはRループのシーケンスに既存のショートリードシーケンスプラットフォームを利用しています。つまり、これらのプラットフォームに内在するすべての制約がDRIP-seqにも当てはまります。特に、一般的なショートリードシーケンスプラットフォームでは、GCリッチ領域でリードカバレッジが不均一になります。Rループは主にシトシンリッチなDNA領域に形成されるため、長いRループのシーケンスは困難を伴う可能性があります。さらに、GCリッチ領域は本質的に複雑性が低い傾向があり、ショートリードアライナーでは一意のアライメントを生成することが困難です。

Rループ形成の解析とプロファイリングには他にもいくつかの方法があるが、^{[ 5 ] [ 13 ] [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ] [ 17 ] [ 18 ] [ 19 ] [ 20 ]}ゲノムワイドスケールで網羅性と堅牢性を提供するものはごくわずかである。^{[ 1 ] [ 3 ]}

• 非変性ビスルフィット修飾およびシークエンシング：この方法は、ビスルフィット処理とそれに続くシークエンシングから成り、亜硫酸水素ナトリウムのssDNAに対する変異誘発効果に依存しています。この方法は主に特定のCpGアイランドプロモーターの位置特定に使用されますが^{[ 1 ]} 、小規模なRループ^{[ 5 ]}やその他のssDNA脆弱部位^{[ 21 ]の検出にも使用されました。}
• DNA:RNA In Vitro Enrichment (DRIVE-seq) : ^{[ 1 ]}この方法は、Rループの回収にS9.6 mAbの代わりにMBP-RNASEH1エンドヌクレアーゼを使用する点を除いて、DRIP-seqと非常によく似た原理を共有しています。MBP-RNASEH1は、追加のキャプチャアッセイが必要な場合にS9.6 mAbの代替手段となりますが、このエンドヌクレアーゼの過剰発現は、生体内で細胞毒性リスクをもたらす可能性があります。
• DNA:RNA免疫沈降法に続いてタイリングマイクロアレイ上でハイブリダイゼーションを行う方法（DRIP-chip）：^{[ 3 ]}この方法もS9.6 mAbの使用に依存している。ただし、シーケンスパイプラインに入る代わりに、DRIP-chipの免疫沈降物質はマイクロアレイにハイブリダイズされる。DRIP-chipのDRIP-seqに対する利点は、データの迅速な取得である。この技術の制限要因は、チップマイクロアレイ上のプローブの数とDNA配列情報がないことである。

• 免疫沈降
• ChIPシーケンス
• DNAシーケンシング