古代病原体のゲノム解析

古代 病原体 ゲノミクスは、古代の人間、植物、動物の遺体から回収された病原体ゲノムの研究に関連する科学分野です。 ^[1]古代病原体とは、過去数世紀に世界中でいくつかの疫病や死を引き起こした、現在は絶滅した微生物です。古代DNA （aDNA）と呼ばれるそのゲノムは、これらの病原体によって引き起こされたパンデミックの犠牲者の埋葬地の残骸（骨や歯）から分離されます。

古代病原体ゲノムのゲノム特性を分析することで、研究者は、仮説上新たなパンデミックやアウトブレイクを引き起こす可能性のある現代の微生物株の進化を理解することができます。aDNAの分析は、バイオインフォマティクスツールと分子生物学技術によって行われ、古代病原体と現代の子孫を比較します。この比較により、これらの株の系統発生情報も得られます。 ^[2]

古代遺跡における病原体 DNA の検出は、実験室または計算手法で行うことができます。どちらの場合も、手順は古代の標本からのDNA の抽出から始まります。実験室手法は、 NGSライブラリの構築とそれに続くキャプチャベースのスクリーニングに基づいています。計算ツールは、NGS によって取得されたリードを単一または複数のゲノム参照に対してマッピングするために使用されます (ターゲット アプローチ)。または、メタゲノムプロファイリングまたはショットガン NGS リードの分類割り当て手法を適用することもできます (広範なアプローチ)。^[1]

保存状態が限られているため存在量が少なく、断片化や損傷が著しく、現代の DNA 汚染や環境 DNA 背景が存在するため、古代 DNA ( aDNA ) の回収は困難な手順となります。^[要出典]

aDNAを効率的に回収するために、DNAは通常、考古学的記録に豊富に含まれる骨や歯などのaDNAを多く含む組織から分離されます。^[1]病原体のさまざまな解剖学的要素にわたる保存状態は、病原体の種類や組織向性、体内への侵入経路、結果として生じる疾患によって大きく異なります。宿主に慢性感染症を引き起こす病原体は通常、急性の血液媒介感染症とは対照的に、診断上の骨変化を引き起こします。^[1]そのため、急性期に宿主の死を引き起こした感染症の場合、好ましいサンプル材料は歯の内腔です^{[1] [3]}これは、生前に血管が豊富な組織であるためです。^[4]

aDNAは時間の経過とともに蓄積される損傷を特徴としています。計算ツールによるDNAの「損傷パターン」の評価は、現代の汚染物質には同じパターンが見られないため、古代の病原体DNAの真正性を証明するのに役立ちます。^[5]

死後のDNAに影響を及ぼす最も代表的な化学的損傷は、シトシンの加水分解による脱アミノ化で、シトシンはウラシルに変換され、その後チミンとして読み取られます。この反応により、古代DNAには、特に分子の末端で、予想外の割合でシトシンからチミンへの遷移が含まれています。^{[6]シトシンがメチル化されたときに発生するシトシンからチミンへの脱アミノ化の他に、その他の一般的なDNA修飾には、脱}塩基部位と一本鎖切断の存在があります。 ^[5]

aDNAは広範囲に断片化されており（断片のほとんどは100塩基対未満の長さです）、この傾向は、現代の汚染分子はより長いと予想されるため、真正性の定量的な尺度として使用できます。^{[4]古代DNAのこの特徴を利用するために、DNA結合}バッファーの量と組成を変更した改良シリカベースの抽出プロトコルが導入されました。^[5]

第二世代のシーケンシング法で配列を決定するには、テンプレート分子をアダプターの連結によって変更する必要があります。^[7]ライブラリ構築のステップとそれに続くPCR増幅の両方でエラーが発生する可能性があります。特に、アダプター結合バイアスが発生する可能性があり、構築物を増幅する際のPCR酵素の相対的な有効性が変化する可能性があります。^[5]

aDNAライブラリには、最も一般的な3つのタイプがあります。二本鎖DNAライブラリは二本鎖DNAテンプレートを使用し、まずaDNA断片の末端を修復するステップが必要です。次に、断片を二本鎖アダプターに連結し、結果として生じた切れ目を埋めます。この方法には、異なるアダプターの両方を含まないコンストラクトの一部が存在することや、アダプター二量体が形成される可能性があることなど、いくつかの制限があります。^[5]

この後者の問題を克服するために、A テール ライブラリの構築方法が開発されました。この方法では、aDNA の末端を修復し、次に鎖の 3' 末端にアデニン残基を追加します。これにより、テンプレートとチミン テーラーを含むアダプターとの連結が容易になります。さらに、これらの T テール アダプターを使用すると、アダプター二量体の形成が防止されます。通常使用されるアダプターの種類は二本鎖で Y 字型です。つまり、T テールの末端に相補的な領域があり、もう一方の末端に非相補的な領域があります。このタイプのアダプターを使用すると、一方向のシーケンシングに役立つ、両端に異なる非相補的なアダプター配列が挟まれた aDNA テンプレートを生成できます。^[5]

もう 1 つの戦略は、一本鎖 DNA ライブラリの使用に基づいています。この方法では、まず DNA を熱で変性させて一本鎖を生成し、次に一本鎖のビオチン化アダプターに連結します。次に、DNA 鎖はDNA ポリメラーゼによってテンプレートとして使用され、相補鎖が生成されます。続いて、2 番目のアダプターが相補鎖の 3' 末端に連結され、完全な構造が PCR によって増幅され、その後配列が決定されます。精製ステップは、この手順の段階で DNA の損失を最小限に抑えることができるストレプトアビジンでコーティングされた常磁性ビーズを使用して実行されます。^[5]

古代遺跡中の内因性DNAへのアクセス性を向上させるために、さまざまな方法（エンリッチメント法と呼ばれる）が開発されてきた。これらのアプローチは、主に3つのタイプに分けられる。ライブラリ構築中に使用されるもの（高レベルの損傷を特徴とするaDNA断片を優先的に組み込む）、ライブラリ構築後に適用されるもの（溶液中またはマイクロアレイ上の所定のプローブセットへのアニーリングを通じて外因性および内因性画分を分離する）、または制限酵素とプライマー伸長捕捉（PEC）を使用した環境微生物DNAの標的消化に基づくものである。^[5]

ライブラリの構築中、ssDNA フラグメントはビオチン化アダプターを介してストレプトアビジンでコーティングされたビーズに結合されます。ポリメラーゼ伸長ステップでは、元のテンプレートに相補的な DNA 鎖が生成されます。この種の濃縮では、コンストラクトは5' 末端でリン酸化され、非リン酸化アダプターのライゲーション (アダプターの 3' 末端と新しく合成された鎖の 5' 末端とのライゲーション) が可能になります。次に、DNA はウラシル DNA グリコシラーゼ(UDG) とエンドヌクレアーゼ VIII (USER ミックス) で処理されます。UDG は死後にウラシルに脱アミノ化されたシトシンに脱塩基部位を生成し、エンドヌクレアーゼ VIII は結果として生じた脱塩基部位を切断します。この切断によって新しい 3' 末端が生成され、これが脱リン酸化されて 3'OH 末端となり、これを新しい伸長ステップの開始点として使用できます。その結果、損傷した鎖は損傷した領域から結合したビーズに向かって伸長します。新しいDNA分子が合成される一方で、元の断片は置き換えられます。その結果、新たに形成されたdsDNA分子にはビーズに結合したアダプターが含まれなくなり、上清には脱アミノ化されたシトシンを元々含んでいた鎖のdsDNAライブラリが残り、さらなる増幅と配列決定が可能になります。損傷していないDNAテンプレート部分は常磁性ビーズに付着したままです。^[8]

このアプローチは、ライブラリの構築後に単一の微生物のみをスクリーニングするための溶液中のターゲットプローブハイブリダイゼーションに基づいています。これは種特異的なアッセイであり、DNAライブラリの熱変性と、近縁種の新鮮なDNA材料が利用できる場合は長距離PCRを使用したプローブDNAライブラリの構築、またはオリゴヌクレオチドのカスタム設計と合成が必要です。^[5]この方法は、標的となる微生物がわかっている場合、たとえば、伝染病の原因物質の仮説がある場合や、研究対象の個体に骨格病変がある場合に役立ちます。^[1]

ライブラリを構築した後に適用されるもう一つの強化戦略は、マイクロアレイを直接適用することです。マイクロアレイは、さまざまな病原微生物を同時に検索する、幅広い実験室ベースの病原体スクリーニングに適用されます。この種のアプローチは、物理的な骨格の証拠を残さず、その存在を事前に簡単に仮定できない病原体に適しています。プローブは、さまざまな病原性ウイルス、寄生虫、細菌の保存された領域または固有の領域を表すように設計されています。^[5]

マイクロアレイには古代病原体の現代株に由来する配列が含まれているため、この方法の限界は、最も異なるゲノム領域の検出が不十分であることと、重要なゲノム再編成や未知の追加プラスミドを含む領域が省略されることです。^[5]

全ゲノム溶液捕捉法 (WISC) により、古代個体の全ゲノム配列を特徴付けることができます。この技術は、標的 aDNA サンプルに近縁な種から採取した新鮮な現代 DNA 抽出物のin vitro転写によって生成された、ゲノム全体のビオチン化 RNA プローブ ライブラリの使用に基づいています。熱変性した aDNA ライブラリは、RNA プローブにアニールされます。厳密性を改善し、反復頻度の高い領域の濃縮を減らすために、低複雑性の DNA とアダプターをブロックする RNA オリゴヌクレオチドが追加されます。次に、関心のあるライブラリ フラクションが、ストレプトアビジンでコーティングされた常磁性ビーズ (RNA プローブが結合している) からの溶出によって回収されます。^[9]

NGS によって得られた配列データの分析は、現代の DNA に使用されているものと同じ計算手法に依存していますが、いくつかの特殊性があります。aDNA からの読み取りを参照ゲノムに対してアラインメントするために広く使用されているツールは PALEOMIX パッケージです。このパッケージは、mapDamage2 を通じて DNA 損傷レベルを定量化し、系統ゲノムおよびメタゲノム解析を実行できます。アラインメントでは、配列エラーや多型ではなく、損傷した塩基の存在に起因する、不一致のヌクレオチドのかなりの部分が常に表示されることを考慮することが重要です。このため、読み取りから参照への編集距離の許容しきい値は、参照ゲノムへの系統発生距離に応じて選択する必要があります。アラインメントを改善するために、aDNA の損傷パターンを考慮した確率的アライナーが開発されています。^[5]

病原体の古代DNAの研究は、感染の結果外観が変化する骨格コレクションに限定されています。既知の疫学的状況に関連する病原体は、その存在を事前に知らなくてもスクリーニングによって特定されます。方法には、蛍光ハイブリダイゼーションベースのマイクロアレイ技術による病原体検出、特定の微生物領域のDNA濃縮による識別、またはヒトマイクロバイオームデータセットに対する非濃縮配列データの計算スクリーニングに焦点を当てた広範囲の分子アプローチが含まれます。これらのアプローチは改善をもたらしますが、種レベルの割り当てに使用される細菌分類群に偏りが残っています。^[10]

MEGAN アラインメント ツール (MALT) は、古代 DNA の識別のための高速アラインメントおよび分類割り当て方法の新しいプログラムです。MALT は、高度に保存された配列と参照間のローカル アラインメントを計算する点でBLASTに似ています。MALT は、読み取りがエンドツーエンドでアラインメントされるセミグローバル アラインメントも計算できます。すべての参照、完全な細菌ゲノムは、国立生物工学情報センター (NCBI) RefSeq と呼ばれるデータベースに含まれています。MALT は、malt-build と malt-run の 2 つのプログラムで構成されています。Malt-build は、指定された参照配列のデータベースのインデックスを作成するために使用されます。代わりに、malt-run は、クエリ配列のセットを参照データベースに対してアラインメントするために使用されます。次に、プログラムはアラインメントのビット スコアと期待値(E 値) を計算し、ビット スコア、E 値、またはパーセント同一性のユーザー指定のしきい値に応じて、アラインメントを保持するか破棄するかを決定します。ビットスコアは、現在の一致が偶然に見つかる可能性がある配列データベースの必要サイズです。ビットスコアが高いほど、配列の類似性は高くなります。E値は、偶然に見つかる可能性がある、同様の品質（スコア）のヒットの予想数です。E値が小さいほど、一致は良好です。^[10]

MALT は、過去の疾病発生に関与する未知の候補細菌病原体の検索や環境細菌背景の排除において、非エンリッチ配列データのスクリーニングを可能にする。MALT は、特定の標的生物を選択せず​​にゲノムレベルのスクリーニングを行えるという利点があり、他のスクリーニング手法によくあるエラーを回避できるため、非常に重要である。候補の分類学的割り当てを認証するには完全なアラインメントが必要であるが、標的 DNA は少量しか存在しないことが多いため、マークされた領域が少数では識別に十分でない可能性がある。この手法では細菌 DNA とウイルス DNA しか検出できないため、集団内に存在する可能性のある他の感染性因子を識別することはできない。この方法は、古代および現代の疾病の原因となる病原体の特定を扱う研究、特に候補生物が事前にわかっていない場合に役立つ。^[10]

現在利用可能なさまざまなシーケンシング技術の興味深い応用例の1つは、疫学、病原体の進化、そして人類の歴史における重要かつ長年の疑問に答えるために、歴史的な病気の発生を調査することです。^[2]

そのため、ペストやココリツトリの流行など、歴史的に重要な感染症の病因についてより多くの情報を見つけ、ウイルスの地理的拡散を説明し、実際には進化のプロセスのアクティブな要素であるこれらの感染性因子の発症メカニズムを定義するために、多くの努力が費やされています。今日、Y.pestisとS.entericaは人間に無害であるように見えますが、科学者は依然としてこれらの細菌の遺伝的適応の長期的な追跡と進化の変化率の正確な定量化に興味を持っています。これは、過去の知識から将来の伝染病に対する戦略を開発するための適切なアイデアを引き出すことができるためです。^[2]

細菌やウイルスは自然界で最も変化しやすい要素の 1 つであり、無限に突然変異を起こしやすいという事実を十分に認識しており、病原性ウイルスの発生に影響を与える可能性のあるすべての外部要因を管理することは不可能であると当然のこととして、ペストや過去の他の感染性因子の新たな発生の可能性を克服することについて話している人はいません。ここでの目的は、新しい危険な病原体が出現したときに備えるための戦略、つまり「ガイドライン」を定義することです。感染における環境の寄与を定義する必要があり、人間の移住、気候変動、都市の過密、動物の家畜化などの要因は、病気の発生と蔓延に寄与する主な原因の一部です。もちろん、これらの要因は予測不可能であり、これが研究者が今日と明日に役立つ可能性のある過去の関連情報を持ち込もうとしている理由です。彼らは、診断、分子、高度なツールを使用して、新たな脅威を克服するための戦略を開発し続けていますが、古代の病原体が歴史的出来事を通じてどのように進化し、適応してきたかを振り返り続けています。歴史上の病気の毒性のゲノム的基礎についてより多く知れば知るほど、今日そして将来の感染症の出現と再出現についてより深く理解できるようになります。^[2]

ヒト宿主とウイルス病原体との系統関係の分析は、アフリカにおける人類史の始まり以来、何千年もの間、多くの病気がヒトと共進化してきたことを示唆している。 ^[要出典]

特に、病原体との長期にわたる相互作用は、すべての個体が長年にわたり遭遇したすべての感染性因子と接触して生き残ることはできないため、非常に強力な選択であると考えられています。病原体による自然選択は種の進化に関係しています。この相互作用は、すでに人間の人口移動を追跡し、アフリカ内外の人間の移住の流れを再構築するために使用されています。^[11]

この特徴のかなり新しい応用と解釈は、aDNA を使って人類の進化をより深く理解することです。熱帯感染症の多くは、人類の進化の過程で重要な役割を果たしたと考えられます。人間とウイルスの相関関係は、何千年も続いていて、誰も勝てない「戦い」として捉えれば理解できます。ウイルスが他の「戦士」に感染するために特徴を変えたとき、人間は適応度を高める戦略を見つけなければならず、変化の中で生き延びてきました。^[11]

長年にわたるこの継続的な課題において、現代の人類社会を苦しめている感染症やその他の病気に次いで、がんは最近最も謎めいた病気の 1 つとなっています。科学者たちは、腫瘍性疾患がポスト工業化時代の人類社会に限定されているのか、あるいはその起源がもっと昔、おそらく先史時代にまで遡るのかを調査しています。問題は、がんは致命的で進行が早く、間もなく死亡する症例では骨格にほとんど痕跡が残らないこと、骨外腫瘍の場合は存在の痕跡がまったく残らないことです。いずれにしても、がんの病因に関する知識は不完全であり、微生物が感染の役割を担っています。過去の移住運動はウイルスを運んだ可能性があり、熱帯病のリザーバーである可能性があり、がんの素因にもなっています。このため、分子分析技術は考古学的遺物に適用され、人類の進化を研究するだけでなく、腫瘍の疫学と病因を理解するための研究を向上させるためにも使用されています。 aDNAから得られる情報は、病原体の変異を固定し、微生物の存在から進化のプロセスを再構築するために使用することができ、新しいワクチンを開発したり、将来の病原体の脅威を発見したりするのに役立ちます。^[11]

過去に起こったことだけが歴史というわけではありません。人類の遺伝的多様性と自然淘汰を今も引き起こす何かが隠れています。それは何百年も前に人類と接触したものの、今でも世界中の人々の健康に影響を与える可能性があります。伝染病は人類に影響を与え、壊滅させる可能性のある最も頻繁な現象の1つであるため、潜在的な感染因子を検出し、予防し、制御することが重要です。結局のところ、考古学者、遺伝学者、医学者は、人間の健康と寿命に貢献したり、脅かしたり、改善したりする可能性のある病原体の影響を調査することに関心を持っています。^[11]

エルシニア・ペスティスはグラム陰性細菌であり、腸内細菌科に属します。最も近い親戚は、環境種であるエルシニア・シュードツベルクローシスとエルシニア・エンテロコリチカ^{です。 [出典が必要]}

これらはすべて、タイプIII分泌システムをコードするプラスミドpCD1を持っています。染色体タンパク質コード遺伝子の中で、ヌクレオチドゲノム同一性は97％です。それらは、毒性の可能性と感染メカニズムの点で異なります。^[12]

Y. pestis はヒトに適応した細菌ではありません。主な宿主はげっ歯類（マーモット、ネズミ、スナネズミ、ハタネズミ、プレーリードッグなど）で、ノミによってヒトに感染します。この病原体の最も研究されている媒介生物の 1 つがXenopsylla cheopisです。^[要出典]

感染したノミに噛まれた後、細菌は宿主の体内に入り、最も近いリンパ節に移動し、そこで細菌が増殖して、横痃と呼ばれる大きな腫れを引き起こします。細菌は血流（敗血症を引き起こす）や肺（肺炎を引き起こす）に広がることもあります。この肺疾患は、人から人へ直接感染します。^[13]

ペスト菌がこれほど危険になったのは、 ymt （エルシナネズミ毒素）を獲得したためだと判明している。この遺伝子はpMT1プラスミド上に存在し、ノミ媒介動物内で細菌が生き残り、節足動物の中腸での定着を促進し、過去1000年間の大規模なパンデミックを引き起こした。^[13]

Y. pestis は、その病原性と伝染メカニズムにより、他の 2 つの種と区別できます。これらの違いは、細菌にヒトへの侵入特性を与える pPCP1 と、ノミのコロニー形成に関与する pMT1 (細菌染色体遺伝子の機能の一部が失われている) という 2 つのプラスミドによって生じます。^{[引用が必要]}

後期新石器時代および青銅器時代のサンプルにより、Y. pseudotuberculosisとY. pestisの祖先の間の最初の遺伝的分岐を特定することができました。これらの株には、 Y. pestisに毒性を与える特徴がありませんでした。ベクターの定着に必要な遺伝子であるymtが欠けていました。また、バイオフィルム形成に必要な遺伝子の活性型（病原体Y. pestisでは不活性）と、免疫応答の誘導因子である活性フラジェリン遺伝子（ Y. pestisでは擬似遺伝子）を示しました。^[1]

ゲノムの概略と2つのプラスミド（pCD1とpMT1）をイーストスミスフィールド墓地の黒死病の犠牲者（1348-1349年）のサンプルと比較したところ、配列の遺伝的保存性が非常に高いことが強調されました。660年間でわずか97の単一ヌクレオチドの違いでした。^[14]

ロンドン6330株には、同時期（1348～1350年）の他の分離株には見られない変異が見られた。その理由は、ヨーロッパで同時に複数の株が循環していたか、パンデミック中に1つの株が微小進化したためである可能性がある。 ^[14]

ペスト菌によるパンデミックの発生は3回ある：^[要出典]

1. 最初の疫病はユスティニアヌス疫病として知られ、541年から543年にエジプトで最初に発生し、その後コンスタンティノープルと近隣地域に広がりました。ヨーロッパでは西暦750年まで流行しました。系統解析により、両方のゲノムは現在は絶滅した系統に属し、現代中国の系統と密接に関連していることが示され、最初のパンデミックが東アジア起源である可能性が示唆されています。
2. 2 度目のパンデミックは黒死病または大疫病として知られています。1346 年から 1352 年にかけてヨーロッパで発生し、ペストが何度も再発し、18 世紀まで続きました。このパンデミックでは、異なる経路でヨーロッパ大陸に侵入した2 種類のペスト菌株が存在した可能性があります。
3. 3度目のパンデミックは1860年に中国で始まりました。鉄道や蒸気船の使用により、他の国々に急速に広がりました。

ユスティニアヌス疫病に関連する菌株は、系統学的に第 2 次および第 3 次ペスト大流行とは別個の新しい系統に出現した。第 2次流行中に発見されたY. pestisの最初の菌株は生き残り、第 3 次流行に関連する現代の系統 1 を生み出した。^{[引用が必要]}

最初のペスト菌と2番目と3番目のペスト菌株は共通の祖先を持っています。^[2]

最近の研究^{[15]では、}バルセロナ（1300年から1420年の間に死亡）、エルヴァンゲン（1486年から1627年の間）、ボルガル市（1298年から1388年の間）の3つのサンプルからY. pestisのゲノムが回収されました。分析された個人の死亡日は、放射性炭素年代測定によって決定されました。最後のものは、1362年以降に製造されたコインの存在によって確認されました。178人の個人からの223のサンプルのうち、各サイトで1つだけが適切な量のDNAを持っていたため、最終的にバチルスの全ゲノム配列決定（ゲノムキャプチャアッセイを通じて、Y. pseudotuberculosisゲノムのドラフトとして、およびY. pestisのpMT1とpCD1を使用）のために選択されました。^[要出典]

既知の古代ゲノムを用いて作成されたペスト菌系統樹とのアラインメントにより、中国以外ではこれまで考えられていたよりも遺伝的多様性が増加していることが明らかになった。3つの新しいゲノムはすべて分岐1にマッピングされ、黒死病に関連する2つのSNPを持っている（ペスト菌のすべてのゲノムは分岐1の黒死病マップに遡る）。^[14]バルセロナ株はロンドン株と違いはない。ゲノムが得られた2人の個体は、数か月の間隔を置いてペストで死亡している（1348年の春と秋^{[16] [17]}）ことから、ヨーロッパでは遺伝的多様性が低いペストの単一の波が存在したことが強調される。エルワンゲン株は分岐1のサブブランチにマッピングされ、以前に配列決定された株（L'Observance）の祖先である。^[18]これは黒死病中にロンドンとバルセロナで循環していた株の子孫であるが、追加の変異も持っている。したがって、この系統は16世紀（エルヴァンゲン流行）以前に第1系統から分岐した系統であり、現代には子孫は知られていないと考えられています。^[15]

黒死病の分離株と比較すると、ボルガル市の株には次のような特徴があります。

• p3 と p4 は、「ロンドン個体 6330」によって共有されます。
• p6、すべての現代の Branch 1 系統と共有されます。
• p7、この株に特有のもの。

ボルガルシティ株は黒死病に関連するSNPを有しており、東方へのペストの移動の証拠となり得る。これらの発見は、第2次および第3次パンデミックの関連性を説明しようとするモデルの1つを裏付けるものである。このシナリオでは、ヨーロッパへのペストの単一の出口（黒死病の原因）があり、放射線イベントの後、東に移動して旧ソ連とアジアに定着し、そこから18世紀に広がって第3次パンデミックを引き起こした。^[15]

もう一つの仮説は、第3次パンデミックの系統は、中国にすでに存在していたペスト菌株の遺伝的変異によって生成された可能性があるというものである。この仮説は、ヨーロッパでのパンデミックの波と、大陸での蔓延を可能にしたであろう気候変動との相関関係によって実際に裏付けられている。このモデルでは、黒死病の遺伝的多様性（少なくとも4つの異なる系統があり、そのためにはアジアから4つの異なる株が導入される必要があった）を説明できない。^[19]

再び、黒死病の後にヨーロッパで発生した複数のペスト流行を説明しようとするモデルが 2 つあります。

• アジアからのペストの繰り返しの導入。このシナリオは、中国におけるペスト菌の遺伝的変異性を予測する前述の2番目の理論と一致している。 ^[20]
• ヨーロッパには、18 世紀まで継続的な流行を引き起こした病原体保有者(現在は消滅) が存在しました。

どちらのモデルも有効である可能性があり、現在ではどちらか一方が他方より優れていることを証明することはできません。しかし、この研究で配列されたエルヴァンゲン株のゲノムは、都市の地理的位置により東からペストが持ち込まれた可能性を排除する傾向があるため、2番目の仮説の証拠と見なされる可能性があります。^[15]

ペスト菌ゲノムの配列解析により、黒死病に先立つ変異イベントが発見され、現在も蔓延している多くの菌株が生まれた。^[15]

メキシコで16世紀に発生した一連の疫病は、現地のナワトル語で「 huey cocoliztli 」と呼ばれ、先住民アステカ人の死亡率が高くなり、人口崩壊につながった。^[21]これらの疫病はメキシコ史上最悪の疫病の一つと考えられており、その原因は500年以上も謎のままである。^[要出典]

ハーバード大学とマックスプランク研究所の科学者グループは、ネイチャー・エコロジー・アンド・エボリューション誌に研究を発表し、 16世紀にメキシコで大流行した細菌の有力候補としてサルモネラ・ エンテリカを示唆している。 ^[10]多くの研究は、この細菌がヨーロッパ人によって先住民に持ち込まれたことを示唆している。^[要出典]

科学者グループは、テポスコルーラ・ユクンダ市の墓地に埋葬された24体の遺骨の歯から抽出したaDNAを分析し、24体のうち10体からサルモネラ・エンテリカのaDNA痕跡を発見した。また、この細菌がヨーロッパ人によってメキシコに持ち込まれたことを証明するため、ヨーロッパ人の流入前に埋葬されていた5人の遺体を分析した。その結果、接触以前の時代にはサルモネラ・エンテリカの証拠はなかったことが明らかになった。^[10]

科学者たちは、接触時代の疫病墓地から出土した24人の先住民の遺体と、接触以前の時代の墓地に埋葬された5人の遺体の歯からaDNAを抽出した。抽出はaDNA抽出のプロトコルに従って行われた。研究グループは、同時に墓地の土壌サンプルも調べ、サンプルに侵入した可能性のある環境微生物の概要を把握した。^[要出典]

抽出後、ゲノムはイルミナのゲノムアナライザーを使用して配列決定されました。その後、研究者はMALTと呼ばれるバイオインフォマティクスツールを使用して、メタゲノム配列データの分析を行いました。このプログラムを使用すると、研究者は正確なターゲットを指定せずに、抽出された配列を参照と並べることができます。研究者はMALTを2回実行しました。1回目は、 NCBI（国立生物工学情報センター）RefSeqを通じて参照として入手できる完全な細菌ゲノムを使用し、2回目は完全なNCBIヌクレオチドデータベースを使用してウイルスDNAをスクリーニングしました。^{[引用が必要]}

スクリーニングの結果、サンプルから採取された 10 から 24 までの配列でSalmonella enterica DNA の存在が陽性となり、3 つの歯のサンプルでは S. entericaに割り当てられた読み取りが大量にありました。特に、サンプル中に存在する主要なS. enterica株は S. Paratyphi C です。この株はヒトに腸チフスを引き起こします。接触以前の時代のサンプルでは S. entericaの証拠は見つからず、 S. enterica は地元の細菌ではないという仮説を裏付けています。 ^{[引用が必要]}

3 つの陽性歯サンプルにおける aDNA の損傷の典型的なパターンを特定するために、データセットをS. Paratyphy C ゲノム参照にマッピングすることによって、さらに分析が行われました。結果は陽性であり、ココリッツィリの原因が S.entericaであるという説を裏付けました。

分析を詳細に進め、この仮説を確認するために、研究者らはさらなる実験と計算分析を行った。彼らは、現代のS. entericaゲノムの違いを含むプローブとS. paratyphi Cを参照として使用して、全ゲノムターゲットアレイと溶液中ハイブリダイゼーションキャプチャを実行した。ハイブリダイゼーションは10個の陽性サンプルで成功し、他のサンプルでは古代DNAが陰性であった。^[10]

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