亜鉛フィンガーキメラ

ジンクフィンガータンパク質キメラは、DNA結合ジンクフィンガータンパク質ドメインと、タンパク質が効果を発揮する別のドメインから構成されるキメラタンパク質です。エフェクタードメインは、転写活性化因子（A）またはリプレッサー（R）、^[1]メチル化ドメイン（M）またはヌクレアーゼ（N）である可能性があります。^[2]

内因性 DNA 結合ジンクフィンガードメインの改変は、遺伝子特異的人工転写因子の構築における最も先進的な分野の基礎です。^[1] 6 つの ZFP を連結すると、18～19 bp のターゲット サイトが生成されます。その 1 つの配列に特異性があり、ゲノムの配列がランダムであると仮定すると、18 bp はすべての既知のゲノムで一意になるのに十分な長さです。 ^{[3] [4]}実際、サブサイト間の間隔は、制御可能なタンパク質の柔軟性の制限により、ターゲット シーケンスの一部になります。^[1] 9 bp ほどの小さなターゲット サイトでも、ある程度の特異性が得られますが、これはほぼ間違いなく、一部はクロマチン閉塞によるものです。^[4]

調査の要件に応じて、ZFP ベースの転写因子の特異性を付与する DNA 認識ドメインを定義するために利用できる手法がいくつかあります。構成するジンク フィンガーの並列、連続、または二部選択を含む 3 つのファージ ディスプレイ戦略が説明されています。

並列選択（図 1 (A)）アプローチでは、個々のジンクフィンガードメインが機能的に独立していると想定しています。これに基づくと、既存の所定のドメインを追加の設計や選択なしで使用できるはずであり、どの研究室でも迅速かつアクセス可能な手法となります。^{[5] [6]}これはすべてのケースに当てはまるわけではなく、この戦略では、後述するように、いくつかのターゲット配列でターゲットサイトの重複に関連する問題が発生する可能性があります。必要に応じて、ターゲットサイトの重複が発生する 2 つのジンクフィンガーのインターフェースでアミノ酸残基をランダム化することで、この問題を克服できる可能性があります。^[5]

1997 年に Pabo グループが提唱したシーケンシャル選択 (図 1 (B)) は、ジンクフィンガー間の協同的結合を利用して、親和性と特異性が非常に高い DNA 結合ドメインを生成するものです。^[7]名前が示すように、各フィンガーは、以前に選択されたフィンガーのコンテキストでランダム化されたライブラリから選択されます。選択に使用される手法は、選択に使用されるターゲットオリゴヌクレオチドにターゲット配列全体が含まれることを除いて、以下に説明する手法と似ています。図 1 に示すように、フィンガー 3 にランダム化されたアルファヘリックスを含むライブラリが作成されます。結合特性が最も優れたドメインが選択され、次に別のライブラリに追加されます。このライブラリでは、フィンガー 1 のアンカーが削除され、もう 1 つのランダム化されたフィンガーが反対側の端に追加されます。これが継続され、隣接するフィンガーのコンテキストですべてのフィンガーが選択された DNA 結合ドメインが生成されます。各ラウンドの選択は同じ最終ターゲット配列に適用されるため、ターゲットサイトの重複は依然として発生しますが、障害ではなく利点となります。

このアプローチの主な欠点は、各ジンクフィンガーごとに個別のライブラリを作成する必要があることです。これは、ほとんどの研究室の能力を超えています。

二部選択法（図1（C））は、並列選択戦略と順次選択戦略の妥協案として、Isalanら（2001）^[8]によって提案されました。9bpの標的部位の最初と最後の5bpが並列に選択され、組み合わせてライブラリが生成され、そこから最終的なZFPが選択されます。

ライブラリのサイズを適切な範囲内に抑えるために、この技術は塩基認識に関与する重要な残基のみのランダム化に制限されています。さらに、並列選択とは異なり、この技術では新しいZFPを構築する前に複数回のパンニングが必要です。^[6]

特定の DNA 配列に結合するジンクフィンガーのアルファヘリックス内の最も適切なアミノ酸配列を決定するために、ファージディスプレイを含む技術が使用される場合があります。選択したバクテリオファージのゲノムを変更することで、タンパク質コートの一部として ZFP を表示するファージを作成できます。その後、このようなファージは、付着したジンクフィンガーを介して、目的の配列を含むオリゴヌクレオチドへの付着をテストすることができ、その間、付着していない他のファージは洗い流されます。ファージ内の DNA は発現した ZFP をコードしているため、結合したファージの DNA を抽出して配列決定すると、特定の配列に結合するのに適したアミノ酸構成に関する情報が得られます。これが、ファージディスプレイによる ZFP 結合の調査の基礎となります。^{[9] [10]}

研究は通常、マウスZFP-TF Zif268またはその誘導体の1つを使用して、ジンクフィンガー配列の改変の基礎として実行されます。これは、すべてのジンクフィンガータンパク質の中で最もよく特徴付けられているためです。^{[3] [10]}その誘導体C7またはC7.GATは、優れた結合親和性と特異性のためによく使用されます。 C7.GATは、C7の3番目のフィンガーがフィンガー2配列の5'位置でグアニンまたはチミンを定義するため（ターゲット部位の重複）、5'-ANN-3'および5'-CNN-3'ファミリーの配列を調査するために使用されています。^{[4] [10] [11]} 繊維状 ヘルパーファージとラムダファージのDNAは、ファージディスプレイで使用されます。 日常的に構築できるライブラリのサイズに制限があるため、ランダム化は、X線結晶構造解析によって推定されるZFP配列で最も影響力のあるアミノ酸に限定される場合があります。 Wuら(1995)[10]が発表した研究では、フィンガー1と3ではヘリックス位置-1、2、3、4、5、6、フィンガー2では位置-2、-1、1、2、3、4であると特定されましたが、Segalら(1999) ^[3]による別の研究では、一部のアミノ酸の非特異的親和性と、隣接する相互作用を安定化させる他のアミノ酸の能力により、-2から6までのすべての位置が重要であることが示唆されています。

単一サブサイトで変化が起こっているZFP結合部位を含む短い（約34 nt）ヘアピンDNAがターゲットとして使用されます。使用されるオリゴヌクレオチドは、5'末端に一次n-ヘキシルアミノ基を含むように合成され、後にウシ血清アルブミン（BSA）を付着させるために使用されます。この場合、コンジュゲートを使用してマイクロタイターウェルをプレコートしてから、約10 ¹³コロニー形成単位のファージを適用します。インキュベーション後、ファージを取り除き、プレートを0.5％Tween 20を含むバッファーで洗浄して、非接着ファージを取り除きます。^{[10]酸性溶出バッファーを使用して、接着ファージを取り除き、}トリス塩基で中和します。^[9]サンプルの濃縮を確実にするために、溶出されたファージとヘルパーファージを細菌細胞に感染させ、生成された[ZFP表示]ファージを収集して次のパンニングラウンドに回します。BSAの代わりに、ヘアピン標的DNAをビオチン化し、後でストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズを使用して抽出することもできます（ストレプトアビジンはビオチンと非常に強い結合を形成します）。^[3]

選択されたファージの特異性を高めるために、特に大規模なライブラリを調査する場合、競合オリゴヌクレオチドを使用して、ビオチン化ターゲットオリゴヌクレオチドを追加する前に、特異性の低いジンクフィンガータンパク質を隔離します。たとえば、切断されたニシン精子 DNA は、DNA に非特異的に付着してファージに結合します。その後のパンニングでは、ターゲットサブサイトの配列以外はすべて同じままで、1 つのヌクレオチドの違いまで、特別に合成された非ターゲットオリゴヌクレオチドの濃度を高めます。特に、突然変異誘発の対象となった元の ZFP のターゲット配列は、ライブラリを汚染する「親ファージ」を選択するために大量に使用されます。ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズの結合は、ブロットおよび抗体表示 (無関係な) ファージによってブロックできるため、結合はビオチンなどの高い親和性を持つ分子に対してのみ発生します。非特異的ファージは、希釈したTween 20を含む緩衝液を使用して、前と同様に除去される。結合したファージは磁気ビーズによって収集され、トリプシンとのインキュベーションによって溶出される。このようにして、高度に特異的なZFPを表示するファージのみが選択される。^{[3] [11]}

溶出後、ファージをプレートに塗布し、個々のプラーク形成単位から DNA を抽出し、制限し、PAGE で分離した後に適切なサイズの断片を抽出します。次に、DNA を配列決定して、ターゲット配列への接着を生成するタンパク質の一次構造を発見します。このプロセスは、調査対象の 5'-NNN-3' シングル フィンガー サブサイトごとに繰り返されます。

改変された Cys ₂ His ₂ジンクフィンガーのアレイを生成することは、目的のゲノム DNA 配列を標的とすることができるタンパク質を作成するための最も発達した方法です。改変されたジンクフィンガーアレイの大部分は、マウス転写因子 Zif268 のジンクフィンガードメインに基づいていますが、一部のグループはヒト転写因子 SP1 に基づくジンクフィンガーアレイを使用しています。Zif268 には、9 bp の配列に集合的に高親和性で結合する 3 つの個別のジンクフィンガーモチーフがあります。^[12] DNA に結合したこのタンパク質の構造は 1991 年に解明され^[13]、改変されたジンクフィンガーアレイに関する多くの研究を刺激しました。1994 年と 1995 年には、多くのグループがファージディスプレイを使用して、Zif268 の単一のジンクフィンガーの特異性を変更しました。^{[14] [15] [16] [17]} Carlos F. Barbas らまた、特許文献においてジンクフィンガー技術の開発が報告されており、ジンクフィンガー技術の商業的開発に重要な特許を多数取得している。^{[18] [19]}典型的な人工ジンクフィンガーアレイは、3～6個の個別のジンクフィンガーモチーフを持ち、9塩基対～18塩基対の長さの標的部位に結合する。6個のジンクフィンガーモチーフを持つアレイは、哺乳類ゲノム内でユニークである可能性が高いほど長い標的部位に結合するため、特に魅力的である。^[20] 現在、人工ジンクフィンガーアレイを生成するために使用されている主な方法は、モジュールアセンブリと細菌選択システムの2つであり、ほとんどのアプリケーションに最も適した方法については議論がある。^{[21] [22]}

新しいジンクフィンガーアレイを生成する最も簡単な方法は、特異性がわかっている小さなジンクフィンガー「モジュール」を組み合わせることです。Pavletich と Pabo が 1991 年の論文で説明した、DNA に結合したジンクフィンガータンパク質 Zif268 の構造は、この研究の多くで鍵となっており、64 の可能な塩基対トリプレットのそれぞれに対してフィンガーを取得し、これらのフィンガーを混合して組み合わせることで、任意の配列特異性を持つタンパク質を設計するという概念を説明しています。^[13] 最も一般的なモジュールアセンブリプロセスでは、それぞれが 3 塩基対の DNA 配列を認識できる個別のジンクフィンガーを組み合わせて、9 塩基対から 18 塩基対の長さのターゲットサイトを認識する 3 フィンガー、4 フィンガー、5 フィンガー、または 6 フィンガーアレイを生成します。別の方法では、2 フィンガーモジュールを使用して、最大 6 つの個別のジンクフィンガーを持つジンクフィンガーアレイを生成します。^[23] スクリプス研究所のバルバス研究室は、ファージディスプレイを使用して、ほとんどのDNAトリプレット配列を認識するジンクフィンガードメインを開発し、特徴付けました^{[24] [25] [26]} 一方、別のグループは、ヒトゲノムから個々のフィンガーを単離し、特徴付けました。^[27] 一般に、モジュラーアセンブリの潜在的な欠点は、個々のジンクフィンガーの特異性が重複することがあり、周囲のジンクフィンガーとDNAの状況に依存する可能性があることです。最近の研究では、モジュラーアセンブリによって生成された3フィンガージンクフィンガーアレイの大部分が、細菌ツーハイブリッドアッセイで十分な親和性で意図したターゲットに結合できず、ジンクフィンガーヌクレアーゼとして機能しないことが実証されましたが、GNNGNNGNN形式のサイトをターゲットにした場合、成功率はいくらか高くなりました。 ^[28]その後の研究では、モジュラーアセンブリを使用して、 3フィンガーアレイと4フィンガーアレイの両方でジンクフィンガーヌクレアーゼを生成し、4フィンガーアレイではるかに高い成功率を観察しました。^[29] 隣接するフィンガーのコンテキストを考慮したモジュラーアセンブリの変種も報告されており、この方法は標準的なモジュラーアセンブリに比べて性能が向上したタンパク質を生み出す傾向がある。^[30]

目的の配列を標的とすることができるジンクフィンガーアレイを生成するために、数多くの選択方法が使用されてきた。初期の選択の試みでは、部分的にランダム化されたジンクフィンガーアレイの大きなプールから、特定の DNA ターゲットに結合するタンパク質を選択するためにファージディスプレイが使用された。この技術は、一度に複数のジンクフィンガーに使用することは難しいため、一度に 1 つのジンクフィンガーを追加して最適化することで、完全に最適化された 3 フィンガーアレイを生成する多段階プロセスが開発された。 ^[31] 最近の試みでは、酵母の 1 ハイブリッドシステム、細菌の 1 ハイブリッドおよび 2 ハイブリッドシステム、および哺乳類細胞が使用されている。新しい 3 フィンガージンクフィンガーアレイを選択する有望な新しい方法は、細菌の 2 ハイブリッドシステムを使用し、その作成者によって「OPEN」と名付けられている。^[32] このシステムは、特定のトリプレットに結合するようにそれぞれ選択された個々のジンクフィンガーの事前選択されたプールを組み合わせ、次に 2 回目の選択を使用して、目的の 9 bp 配列を結合できる 3 フィンガーアレイを取得する。このシステムは、Zinc Finger Consortium によって、人工 Zinc Finger アレイの市販品の代替として開発されました。OPEN 法で生成されたタンパク質の特異性プロファイルはこれまで報告されていないため、この方法で生成されたタンパク質の結合特性をモジュラー アセンブリで生成されたタンパク質と直接比較することはやや困難です。

人工ジンクフィンガーアレイは、人工転写因子、ジンクフィンガーメチラーゼ、ジンクフィンガーリコンビナーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼなど、数多くの用途に使用できます。^[33]細菌TALエフェクターの別のDNA結合ドメイン を使用した初期の研究では有望性が示されていますが、^{[34] [35] [36] [37]}これらのドメインが、現在人工ジンクフィンガーが使用されているアプリケーションの一部またはすべてに適しているかどうかはまだわかりません。 人工ジンクフィンガーアレイを使用した人工転写因子は、数多くの科学的研究で使用されており、VEGFの発現を活性化する人工転写因子は現在、いくつかの臨床適応症の潜在的な治療薬としてヒトで評価されています。 ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ショウジョウバエ、線虫、タバコ、トウモロコシ、^[23]ゼブラフィッシュ、^[38] 様々な種類の哺乳類細胞、^[39]ラット[ ⁴⁰ ]など、多くの高等生物のゲノムを操作するための有用な試薬 となっている。 現在進行中の臨床試験では、 CD4 + ヒトT細胞のCCR5遺伝子を破壊するジンクフィンガーヌクレアーゼを、HIV / AIDSの潜在的な治療薬として評価している。^[41]

これらの調査では、可溶性ZFPを使用する必要があります。これは、ファージへの付着によってジンクフィンガーの結合特性が変化する可能性があるためです。^[3] ZFPが選択されると、その配列がpComb3Hから改変された細菌発現ベクターpMal-c2にサブクローニングされ、マルトース結合タンパク質をコードする配列にリンクされます。次に、組み換え体をXL1-Blue細胞に形質転換し、イソプロピルβ-D-チオガラクトシド（IPTG）の添加によって発現を誘導します。その後、凍結/解凍抽出物を精製して、次の実験に使用することができます。マルチターゲットELISAでは精製は必要ありませんが、プラズモン共鳴とDNaseフットプリントによる結合親和性の測定には精製が不可欠です。これは、亜鉛緩衝液で平衡化したヘパリンセファロースFPLCカラムを使用して実施し、その後SDS PAGEゲルデンシトメトリーで均一性を確認することで実施できる^[4]同じ技術を使用して、完成した多指ZFPキメラの結合特性を調べることができる^[42]

ファージディスプレイによって選択された ZFP の特異性は、マルチターゲット酵素結合免疫吸着法(ELISA) を使用してテストされます。ZFP は、ストレプトアビジンとビオチン化ターゲットオリゴヌクレオチドでコーティングされたマイクロタイターウェルに適用されます。インキュベーション後、ウェルは、ターゲット配列に付着していない場合は洗浄してジンクフィンガーを除去し、続いてマウス抗 MBP (マルトース結合タンパク質)抗体を適用してインキュベーションします。アルカリホスファターゼに結合したヤギ抗マウス抗体を加えて結合させ、その後、抗体がジンクフィンガーに結合していない場合は洗浄して抗体を除去します。アルカリホスファターゼ基質を加え、反応を停止した後、分光光度計で 405 nm での光学密度(OD405) を測定します^[4]

分光光度計の読み取り値はウェル内に存在するアルカリホスファターゼの量に依存し、これは問題の ZFP の結合に比例します。ZFP が、あまり高い親和性で選択されていない配列に結合する場合、ほとんどの医療目的には十分な特異性がなく、おそらく拒否されます。

これらのアッセイは、異なる標的オリゴヌクレオチドを使用して繰り返されます。たとえば、5'-XNN-3'配列に結合するジンクフィンガーを調べる場合、考えられるオリゴヌクレオチド配列の16個すべてを調査する必要があります。さらに、5'ヌクレオチドへの特異性をテストするには、4つの5'-ANN-3'、5'-CNN-3'、5'-GNN-3'の完全な補完が必要です。5'-TNN-3'ファミリーは、4つの別々の反応で標的として使用され、それぞれの相対的な結合が比較されます^[4]

速度論的分析は、標的に対するジンクフィンガーの接着の親和性と特異性の両方に関する情報を提供します。これは、表面プラズモン共鳴を利用した市販の装置を使用して実行できます。センサーチップの表面は、同様に表面に接着するビオチン化オリゴヌクレオチドを適用する前に、親和性精製されたストレプトアビジンでコーティングされます。 ^[10]結合速度 (k _on ) は、いくつかの異なるタンパク質濃度を使用して表面への ZFP 結合速度を測定することによって計算され、解離速度 (k _off ) は、結合後の流速を上げることによって計算できます。計算は、機器に付属のソフトウェアによって実行されます。^[10]

あるいは、K _{d は}、同じ精製タンパク質を、ゲル精製された 32P 末端標識された標的オリゴヌクレオチドの連続希釈液とともにインキュベートするゲル移動度シフトアッセイから計算することもできます。インキュベーション反応は、その後、短時間でポリアクリルアミドゲル上で分離され、市販のイメージング装置とソフトウェアを使用して定量化されます。K _{d は}、結合等温線方程式を使用したスキャッチャード分析によって計算されます。θ _b = [ペプチド]/([ペプチド] + K _d )。^{[3] [43]}

ZFP が DNA ターゲットに結合したときに占有する空間を決定するには、ターゲット遺伝子の断片を PCR で増幅し、32P 末端標識プロモーター断片と混合します。次に、この反応物を、前述の過剰発現 (例: pMal-c2 および XL1-Blue) および精製方法のいずれかを使用して生成および精製した、いくつかの異なる濃度の ZFP とともにインキュベートします。DNase Iによる消化により、さまざまな長さの断片が生成されますが、ZFP が高濃度で結合した場合、これらの場所では ZFP によって DNase 活性が遮断されるため、対応する断片長は混合物に存在しません。サンプルは、アクリルアミド(約 6%)、尿素 (8 M) ゲルで分離され、リン光イメージング プレートを露光するために使用され、市販のリン光イメージング マシンによって記録されます。ソフトウェア分析を使用して K _d値を生成することもできます^[4]

アミノ酸残基の特定の配列は、4ヌクレオチドまたは5ヌクレオチドの拡張された標的部位を認識し、それに特異的である^[44]。3ヌクレオチドのサブサイトが連続しているZFPでこれが発生すると、1つのジンクフィンガーが隣接するジンクフィンガーの標的部位に干渉し、標的部位の重複と呼ばれる状況が発生します。

ZFP-TF は、活性化因子と抑制因子から構成され、ジンクフィンガータンパク質ドメインと、ZFP ドメインが結合する任意の配列の周囲に調節効果を発揮するさまざまな転写因子エフェクタードメインのいずれかで構成される転写因子です。

ジンクフィンガーヌクレアーゼには、ジンクフィンガータンパク質ドメインが結合する任意の配列の遺伝子座で二本鎖切断を導入することができる FokIなどのヌクレアーゼドメインが含まれます。

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