シーケンシング

遺伝学と生化学において、配列決定とは、分岐していない生体高分子の一次構造（誤って一次配列と呼ばれることもある）を決定することを意味します。配列決定の結果、配列決定された分子の原子レベルの構造の多くを簡潔に要約した、シーケンスと呼ばれる記号的な線形描写が得られます。

DNA配列解析

DNA シーケンシングは、特定のDNA断片のヌクレオチドの順序を決定するプロセスです。これまでのところ、ほとんどの DNA シーケンシングは、フレデリックサンガーが開発した連鎖終結法を使用して実行されています。この技術は、修飾されたヌクレオチド基質を使用して DNA 合成反応の配列特異的終結を使用します。しかし、ピロシーケンシングなどの新しいシーケンシング技術が、シーケンシング市場でますますシェアを獲得しています。現在、サンガー DNA シーケンシングよりもピロシーケンシングによって生成されるゲノムデータが多くなっています。ピロシーケンシングにより、迅速なゲノムシーケンシングが可能になりました。この技術を使用すると、細菌ゲノムを 1 回の実行で複数回カバーしてシーケンシングできます。この技術は、最近、ジェームズワトソンのゲノムのシーケンシングにも使用されました。^[1]

DNA の配列は、生物が生存し、繁殖するために必要な情報をコード化しています。したがって、配列を決定することは、生物がなぜ、どのように生きるかに関する基礎研究だけでなく、応用分野でも役立ちます。生物にとって DNA が重要な役割を果たすため、DNA 配列の知識は、生物学研究のほぼすべての分野で役立ちます。たとえば、医学では、遺伝病の特定、診断、および治療法の開発に使用できます。同様に、病原体の研究は、伝染病の治療につながる可能性があります。バイオテクノロジーは、多くの有用な製品やサービスを生み出す可能性を秘めた、急成長中の分野です。

カールソン曲線は、エコノミスト誌 ^[2]がムーアの法則のバイオテクノロジー版を表すために作った造語であり、著者のロブ・カールソンにちなんで名付けられました。^[3] カールソンは、DNAシーケンシング技術の倍増時間（コストと性能で測定）が少なくともムーアの法則と同じ速さになるだろうと正確に予測しました。^{[4]カールソン曲線は、DNAシーケンシング、}DNA合成、タンパク質発現やタンパク質構造の決定に使用されるさまざまな物理的および計算ツールなど、さまざまな技術のコストが急速に（場合によっては超指数関数的に）低下し、性能が向上することを示しています。

サンガー配列決定

連鎖終結シーケンス (サンガーシーケンス) では、テンプレート DNA の特定の部位で、その領域のテンプレートに相補的な短いオリゴヌクレオチド「プライマー」を使用して伸長が開始されます。オリゴヌクレオチドプライマーは、DNA を複製する酵素であるDNA ポリメラーゼを使用して伸長されます。プライマーと DNA ポリメラーゼには、4 つのデオキシヌクレオチド塩基 (DNA の構成要素) と、低濃度の連鎖終結ヌクレオチド (最も一般的にはジデオキシヌクレオチド) が含まれています。デオキシヌクレオチドは、リボース分子の 2' および 3' 位置の両方に OH 基がないため、DNA 分子内に挿入されると、それ以上の伸長が防止されます。このシーケンサーでは、それぞれ 4 つのジデオキシリボヌクレオチドのみを含む 4 つの異なる容器が使用されます。DNA ポリメラーゼによって連鎖終結ヌクレオチドがランダムな位置に取り込まれると、特定のジデオキシリボヌクレオチドで終結する、さまざまなサイズの一連の関連 DNA フラグメントが生成されます。次に、断片はスラブポリアクリルアミドゲル、または現在ではより一般的には粘性ポリマーで満たされた細いガラス管（毛細管）内で電気泳動によってサイズ別に分離されます。

色素ターミネーター読み取り例の開始部分の表示 (クリックして拡大)

プライマーのラベル付けの代替として、ターミネーターをラベル付けする方法があります。これは一般に「ダイターミネーターシーケンシング」と呼ばれます。この方法の主な利点は、ラベル付けプライマー法では 4 回必要だったシーケンシングセット全体を 1 回の反応で実行できることです。これは、各ジデオキシヌクレオチド鎖ターミネーターを、異なる波長で蛍光を発する個別の蛍光染料でラベル付けすることで実現します。この方法は、ダイプライマー法よりも簡単で迅速ですが、大きなダイ鎖ターミネーターの組み込みにおけるテンプレート依存の違いにより、より不均一なデータピーク (異なる高さ) が生成される場合があります。この問題は、組み込みのばらつきを最小限に抑える新しい酵素と染料の導入により大幅に軽減されました。この方法は、よりシンプルで安価であるため、現在ではほとんどのシーケンシング反応に使用されています。その主な理由は、プライマーを個別にラベル付けする必要がないことです (これは、使い捨てのカスタムプライマーでは大きな費用がかかります)。ただし、頻繁に使用される「ユニバーサル」プライマーでは、この点はそれほど問題になりません。Illumina、454、ABI、Helicos、Dover の第 2 世代および第 3 世代システムのコスト効率が向上しているため、この状況は急速に変化しています。

パイロシークエンス

ピロシーケンシング法は、ヌクレオチドの取り込み時に放出されるピロリン酸の検出に基づいています。ピロシーケンシングを実行する前に、シーケンスする DNA 鎖を PCR で増幅する必要があります。次に、シーケンサーでヌクレオチドを追加する順序を選択します (つまり、GATC)。特定のヌクレオチドが追加されると、DNA ポリメラーゼがそれを成長中の鎖に取り込む場合、ピロリン酸が放出され、ATP スルフリラーゼによって ATP に変換されます。ATP はルシフェラーゼを介してルシフェラーゼの酸化を促進します。この反応により、パイログラムピークとして記録される光信号が生成されます。このようにして、ヌクレオチドの取り込みは信号と相関します。光信号は、DNA 鎖の合成中に組み込まれたヌクレオチドの量に比例します (つまり、組み込まれた 2 つのヌクレオチドは 2 つのパイログラムピークに対応します)。追加されたヌクレオチドが DNA 分子に組み込まれない場合、信号は記録されません。アピラーゼ酵素は、反応物に残っている取り込まれなかったヌクレオチドを除去します。この方法では、蛍光標識ヌクレオチドもゲル電気泳動も必要ありません。Pål Nyrén と Mostafa Ronaghi DNA によって開発されたパイロシークエンシングは、Biotage (低スループットシークエンシング用) と 454 Life Sciences (高スループットシークエンシング用) によって商品化されています。後者のプラットフォームは、1 台のマシンで 7 時間の実行で約 100メガベース[現在は最大 400 メガベース] をシーケンスします。アレイベースの方法 (454 Life Sciences によって商品化) では、一本鎖 DNA がビーズにアニールされ、EmPCRによって増幅されます。次に、これらの DNA に結合したビーズは、 ATPの存在下で光を発生する酵素とともに、光ファイバーチップ上のウェルに配置されます。このチップ上で遊離ヌクレオチドを洗浄すると、ヌクレオチドが相補的な塩基対と結合してATPが生成され、光が発生します。1つ（または複数）のヌクレオチドを追加すると、機器のCCDカメラによって記録される光信号を生成する反応が起こります。信号の強さは、単一のヌクレオチドフローに組み込まれたホモポリマーストレッチなどのヌクレオチドの数に比例します。[1]

真の単一分子シーケンシング

大規模シーケンシング

上記の方法はさまざまなシーケンシング方法を説明していますが、ゲノムの大部分をシーケンシングする場合は、別の関連用語が使用されます。エクソームシーケンシング(遺伝子をコードするすべての染色体にわたるすべての DNA のサブセット) または全ゲノムシーケンシング(ヒトのすべての核 DNA のシーケンシング) を実行するために、いくつかのプラットフォームが開発されました。

RNAシークエンシング

RNA は細胞内で安定性が低く、実験的にヌクレアーゼ攻撃を受けやすい傾向もあります。RNA はDNA からの転写によって生成されるため、その情報は細胞の DNA 内に既に存在しています。ただし、 RNA 分子の配列を決定することが望ましい場合もあります。DNA の配列を決定すると生物の遺伝子プロファイルが得られますが、RNA の配列を決定すると細胞内で活発に発現している配列のみが反映されます。RNA の配列を決定するための通常の方法は、まずサンプルから抽出した RNA を逆転写してcDNA フラグメントを生成することです。次に、これを上記のように配列決定します。細胞内で発現する RNA の大部分はリボソーム RNAまたは小さな RNAであり、細胞翻訳には有害ですが、研究の焦点ではないことがよくあります。ただし、この部分をin vitro で除去して、通常は含まれるメッセンジャー RNA を濃縮することができます。エクソンに由来するこれらの mRNA は、後で特定の細胞機能をサポートするタンパク質に翻訳されます。したがって、発現プロファイルは細胞活動を示し、特に疾患、細胞挙動、試薬または刺激に対する反応の研究で求められます。真核生物のRNA 分子は、イントロンが除去されるため、必ずしもDNA テンプレートと共線的ではありません。これにより、読み取りシーケンスをゲノムにマッピングし、その起源を特定するための複雑さが生まれます。トランスクリプトーム全体に適用される次世代シーケンシングの機能の詳細については、RNA-SeqおよびMicroRNA シーケンシングを参照してください。

タンパク質配列解析

タンパク質配列決定を実行する方法には以下のものがあります。

タンパク質をコードする遺伝子が分かっている場合、DNA の配列を決定してタンパク質配列を推測することは現在でははるかに簡単です。上記の方法のいずれかを使用してタンパク質のアミノ酸配列の一部 (多くの場合、片方の端) を決定するだけで、この遺伝子を持つクローンを特定するのに十分な場合があります。

多糖類の配列

多糖類も生体高分子であるが、いくつかの理由から多糖類の「配列」について語ることはあまり一般的ではない。多くの多糖類は直鎖状であるが、多くは分岐している。多くの異なるユニット（個々の単糖）が使用され、さまざまな方法で結合することができる。しかし、主な理論的理由は、ここに挙げた他のポリマーは主に 1 つのプロセッシブ酵素によって「テンプレート依存的」に生成されるのに対し、多糖類内の個々の結合は異なる酵素によって形成される可能性があるということである。多くの場合、アセンブリは一意に指定されず、どの酵素が作用するかに応じて、いくつかの異なるユニットの 1 つが組み込まれる可能性がある。これにより、類似した分子のファミリーが形成される可能性がある。これは、植物多糖類に特に当てはまる。オリゴ糖および多糖類の構造決定方法には、 NMR分光法およびメチル化分析がある。 ^[5]

参照

参考文献

^ Wheeler, David A.; Srinivasan, Maithreyan; Egholm, Michael; Shen, Yufeng; Chen, Lei; McGuire, Amy; He, Wen; Chen, Yi-Ju; Makhijani, Vinod (2008-04-17). 「大規模並列DNAシーケンシングによる個体の完全ゲノム」. Nature . 452 (7189): 872–876. Bibcode :2008Natur.452..872W. doi : 10.1038/nature06884 . ISSN 0028-0836. PMID 18421352.
^ ライフ 2.0 (2006 年 8 月 31 日)。エコノミスト
^ カールソン、ロバート H. 生物学は技術である: 生命工学の約束、危険、そして新しいビジネス。ケンブリッジ、マサチューセッツ州: ハーバード大学出版局、2010 年。印刷
^ カールソン、ロバート（2003）。「生物学的技術のペースと増殖」バイオセキュリティとバイオテロリズム：バイオ防衛戦略、実践、科学。1 （3）：203–214。doi ： 10.1089 / 153871303769201851。PMID 15040198 。
^ 「炭水化物の構造解析の実践ガイド」。

リンク

https://www.nature.com/subjects/sequencing

[1] Wheeler, David A.; Srinivasan, Maithreyan; Egholm, Michael; Shen, Yufeng; Chen, Lei; McGuire, Amy; He, Wen; Chen, Yi-Ju; Makhijani, Vinod (2008-04-17). 「大規模並列DNAシーケンシングによる個体の完全ゲノム」. Nature . 452 (7189): 872–876. Bibcode :2008Natur.452..872W. doi : 10.1038/nature06884 . ISSN 0028-0836. PMID 18421352.

[2] ライフ 2.0 (2006 年 8 月 31 日)。エコノミスト

[3] カールソン、ロバート H. 生物学は技術である: 生命工学の約束、危険、そして新しいビジネス。ケンブリッジ、マサチューセッツ州: ハーバード大学出版局、2010 年。印刷

[4] カールソン、ロバート（2003）。「生物学的技術のペースと増殖」バイオセキュリティとバイオテロリズム：バイオ防衛戦略、実践、科学。1 （3）：203–214。doi ： 10.1089 / 153871303769201851。PMID 15040198 。

[5] 「炭水化物の構造解析の実践ガイド」。