遺伝子発現プロファイリング

分子生物学の分野において、遺伝子発現プロファイリングとは、数千の遺伝子の活動（発現）を一度に測定し、細胞機能の全体像を作成することです。これらのプロファイルにより、たとえば活発に分裂している細胞を区別したり、細胞が特定の処理にどのように反応するかを示したりすることができます。この種の実験の多くは、ゲノム全体、つまり特定の細胞に存在するすべての遺伝子を同時に測定します。

解析に必要なデータを生成するために、いくつかのトランスクリプトミクス技術を使用することができます。DNAマイクロアレイ^{[1]は、以前に特定された標的遺伝子の相対的な活性を測定します。RNA} -Seqなどの配列ベースの技術は、遺伝子の発現レベルに加えて、遺伝子の配列に関する情報を提供します。

発現プロファイリングは、ゲノムの配列決定後の論理的な次のステップです。配列は細胞が何をする可能性があるかを示し、発現プロファイルは細胞が特定の時点で実際に何をしているかを示します。遺伝子にはメッセンジャー RNA ( mRNA ) を作成するための指示が含まれていますが、各細胞は、どの瞬間も、保有する遺伝子の一部からのみ mRNA を作成します。遺伝子が mRNA を生成するために使用される場合、その遺伝子は「オン」と見なされ、そうでない場合は「オフ」と見なされます。遺伝子がオンかオフかは、時間帯、細胞が活発に分裂しているかどうか、その局所環境、他の細胞からの化学信号など、多くの要因によって決まります。たとえば、皮膚細胞、肝細胞、神経細胞はそれぞれ多少異なる遺伝子をオン (発現) し、それが主に細胞の違いを生み出しています。したがって、発現プロファイルを使用すると、細胞の種類、状態、環境などを推測できます。

発現プロファイリング実験では、多くの場合、2 つ以上の実験条件で発現した mRNA の相対量を測定する必要があります。これは、特定の mRNA 配列のレベルの変化が、mRNA によってコード化されたタンパク質の必要性の変化を示唆し、おそらく恒常性応答または病理学的状態を示しているためです。たとえば、アルコール脱水素酵素をコードする mRNA のレベルが高い場合、研究対象の細胞または組織が環境中のエタノール レベルの増加に反応していることを示します。同様に、乳がん細胞が特定の膜貫通受容体に関連する mRNA を正常細胞よりも高いレベルで発現している場合、この受容体が乳がんに関与している可能性があります。この受容体に干渉する薬剤は、乳がんを予防または治療する可能性があります。薬剤の開発では、薬剤の毒性を評価するために遺伝子発現プロファイリング実験を行うことがあります。たとえば、薬剤代謝のバイオマーカーである可能性のあるシトクロム P450遺伝子の発現レベルの変化を調べることによって行う場合があります。 ^[2]遺伝子発現プロファイリングは、重要な診断テストになる可能性があります。^{[3] [4]}

ヒトゲノムには約 20,000 個の遺伝子が含まれており、それらが協調して約 1,000,000 個の異なるタンパク質を生成します。これは選択的スプライシングによるものであり、また細胞が最初にタンパク質を構築した後に翻訳後修飾によってタンパク質に重要な変更を加えるため、特定の遺伝子は特定のタンパク質の多くの可能なバージョンの基礎として機能します。いずれにしても、1 回の質量分析実験で約 2,000 個のタンパク質^[5]または全体の 0.2% を特定できます。細胞が正確に生成するタンパク質 (プロテオミクス) に関する知識は、各遺伝子から生成されるメッセンジャー RNA の量を知ることよりも重要ですが、^{[なぜ? ]}遺伝子発現プロファイリングは、1 回の実験で可能な限り最も全体的な画像を提供します。ただし、プロテオミクスの方法論は改善されています。酵母などの他の種では、わずか 1 時間強で 4,000 個を超えるタンパク質を特定できます。^[6]

科学者は、何が起こっているかについての考え、つまり仮説をすでに持っており、その仮説を反証する可能性を考えて発現プロファイリング実験を実行することがあります。言い換えると、科学者は、結果的に誤りとなる可能性のある発現レベルについて、具体的な予測を立てているのです。

より一般的には、発現プロファイリングは、遺伝子が実験条件とどのように相互作用するかについて十分にわかっていて、検証可能な仮説が存在するようになる前に行われます。仮説がなければ反証するものは何もありませんが、発現プロファイリングは将来の実験の候補仮説を特定するのに役立ちます。ほとんどの初期の発現プロファイリング実験、および現在の多くの実験は、クラス発見として知られるこの形式^{[7]を採用しています。クラス発見の一般的なアプローチは、従来の}k-meansや階層的クラスタリング、または最近のMCLなど、多くの既存のクラスタリング手法の 1 つを使用して、類似の遺伝子またはサンプルをグループ化することです。 ^[8]クラスタリング アルゴリズムの選択とは別に、ユーザーは通常、データ オブジェクト間の適切な近接性尺度 (距離または類似性) を選択する必要があります。^[9]上の図は、類似のサンプル (上記の行) と類似の遺伝子プローブ (列) が互いに近くなるように整理された 2 次元クラスターの出力を表しています。クラス発見の最も単純な形式は、2 つの実験条件間で一定量以上変化したすべての遺伝子をリストすることです。

クラス予測はクラス発見よりも難しいですが、このプロファイルを前提とした場合、この患者がこの薬に反応する確率はどれくらいかなど、直接臨床的に重要な質問に答えることができます。これには、反応したプロファイルと反応しなかったプロファイルの多くの例と、それらを区別するための クロス検証技術が必要です。

一般的に、発現プロファイリング研究では、実験条件を変えた際に統計的に有意な差を示した遺伝子が報告されます。これは通常、いくつかの理由からゲノムのごく一部です。第一に、細胞分化の直接的な結果として、さまざまな細胞や組織が遺伝子のサブセットを発現するため、多くの遺伝子がオフになっています。第二に、遺伝子の多くは、生存に非常に特定の量で必要なタンパク質をコードするため、多くの遺伝子は変化しません。第三に、細胞はmRNAの量を変えることに加えて、他の多くのメカニズムを使用してタンパク質を調節するため、これらの遺伝子は、タンパク質濃度が上昇したり下降したりしても、一貫して発現したままになることがあります。第四に、経済的な制約により、発現プロファイリング実験は、同一条件下での同じ遺伝子の少数の観察に制限されるため、実験の統計的検出力が低下し、実験で重要だが微妙な変化を特定することが不可能になります。最後に、調節される各遺伝子の生物学的意義について議論するには多大な労力がかかることから、科学者は多くの場合、議論をサブセットに限定します。新しいマイクロアレイ解析技術では、発現プロファイリング結果に生物学的意義を付与する特定の側面が自動化されていますが、これは依然として非常に難しい問題です。

発現プロファイリング実験から公開される遺伝子リストの長さが比較的短いため、異なる研究室で実施された実験が一致する範囲が制限されます。発現プロファイリングの結果を公的にアクセス可能なマイクロアレイ データベースに配置すると、研究者は公開された結果の範囲を超えて発現パターンを評価し、自分の研究との類似性を特定できるようになります。

DNA マイクロアレイ と定量的 PCR はどちらも、相補的な核酸配列の優先的な結合または「塩基対形成」を利用し、多くの場合は連続的に遺伝子発現プロファイリングに使用されます。ハイスループット DNA マイクロアレイは qPCR ほどの定量的精度はありませんが、qPCR で数十個の遺伝子の遺伝子発現を測定するのにかかる時間は、DNA マイクロアレイを使用してゲノム全体を測定するのとほぼ同じです。そのため、候補遺伝子を特定するために半定量的 DNA マイクロアレイ分析実験を実行し、次に最も興味深い候補遺伝子のいくつかに対して qPCR を実行してマイクロアレイの結果を検証することが理にかなっている場合がよくあります。差次的に発現した遺伝子のタンパク質産物の一部に対するウェスタン ブロットなどの他の実験では、mRNA レベルが発現したタンパク質の量と必ずしも相関しないため、発現プロファイルに基づく結論がより説得力のあるものになります。

マイクロアレイのデータ分析は、熱心な研究分野となっている。^[10]かつては一般的だった、遺伝子群が少なくとも 2 倍制御されていると単純に述べるだけでは、確固とした統計的根拠を欠いている。マイクロアレイでは各グループで 5 回以下の反復実験が一般的だが、1 つの外れ値の観察で 2 倍を超える差が生じる可能性がある。さらに、基準を恣意的に 2 倍に設定することは、生物学的に健全ではない。なぜなら、明らかな生物学的意義を持つ多くの遺伝子を考慮から除外してしまうからである。

倍数変化のカットオフ値を使用して差次的に発現した遺伝子を特定する代わりに、さまざまな統計テストやANOVAなどのオムニバス テストを使用できます。これらのテストはすべて、倍数変化と変動性の両方を考慮して p 値を作成します。p 値は、データが偶然のみで観測される頻度の推定値です。マイクロアレイに p 値を適用することは、多数の比較(遺伝子) が関係するため複雑です。たとえば、p 値 0.05 は、データが偶然に観測される確率が 5% であると推定されるため、通常は有意性を示すと考えられています。しかし、マイクロアレイ上に 10,000 個の遺伝子がある場合、実験グループ間に違いがなくても、500 個の遺伝子が p < 0.05 で有意であると特定されます。 1 つの明らかな解決策は、より厳格な p 値基準を満たす遺伝子のみを有意と見なすことです。たとえば、 p 値に対してBonferroni 補正を実行したり、偽発見率計算を使用して、関連する並行テストの数に比例して p 値を調整したりできます。残念ながら、これらのアプローチでは、遺伝子が実際には差次的に発現している場合でも、有意な遺伝子の数がゼロになる可能性があります。Rank製品などの現在の統計は、偶然の変動による遺伝子の偽発見と、差次的に発現した遺伝子の未発見のバランスを取ることを目的としています。よく引用される方法には、Significance Analysis of Microarrays (SAM) ^{[11]があり、} Bioconductorからはさまざまな方法、バイオインフォマティクス企業からはさまざまな分析パッケージが提供されています。

異なるテストを選択すると、通常、重要な遺伝子のリストも異なります^[12]。これは、各テストが特定の一連の仮定の下で動作し、データ内の特定の特徴に異なる重点を置くためです。多くのテストは、データの正規分布という仮定から始まります。これは、それが合理的な出発点のようであり、より有意に見える結果を生み出すことが多いためです。一部のテストでは、すべての遺伝子観測の結合分布を考慮して測定値の一般的な変動を推定しますが^{[13] 、他のテストでは各遺伝子を個別に調べます。多くの最新のマイクロアレイ解析技術には}、ブートストラップ（統計）、機械学習、またはモンテカルロ法が含まれます^[14]。

マイクロアレイ実験における反復測定の回数が増えるにつれて、さまざまな統計的アプローチから得られる結果はますます似てきますが、異なる統計的手法間の不一致により、アレイ結果の信頼性が低下します。MAQCプロジェクト^[15]では、異なる研究室で実施される実験がより一致するように、研究者がより標準的な方法（例えば、差次的に発現する遺伝子を選択するためにp値と倍数変化を併用する）を選択するためのガイドラインを提示しています。

差次的に発現する個々の遺伝子の解析とは異なり、別のタイプの解析は、定義済み遺伝子セットの差次的発現または摂動に焦点を当てており、遺伝子セット解析と呼ばれています。^{[16] [17]}遺伝子セット解析は、個々の遺伝子の差次的発現解析に比べていくつかの大きな利点があることが実証されています。^{[16] [17]}遺伝子セットは、現在の知識に従って機能的に関連する遺伝子のグループです。したがって、遺伝子セット解析は、知識ベースの解析アプローチであると考えられています。^[16]一般的に使用される遺伝子セットには、 KEGGパスウェイ、遺伝子オントロジー用語、共通の転写調節因子など、他の機能注釈を共有する遺伝子グループから派生したものが含まれます。 代表的な遺伝子セット解析方法には、サンプルラベルの順列に基づいて遺伝子セットの重要性を推定する遺伝子セットエンリッチメント解析(GSEA) ^[16 ]や、遺伝子ラベルの順列またはパラメトリック分布に基づいて遺伝子セットの重要性をテストする一般に適用可能な遺伝子セットエンリッチメント (GAGE) ^[17]があります。

統計により、実験条件下でどの遺伝子産物が変化するかを特定できるかもしれませんが、発現プロファイリングの生物学的意味を理解するには、各遺伝子産物がどのタンパク質を作り、このタンパク質がどのような機能を果たすかを知る必要があります。遺伝子注釈は、特定の染色体内での各遺伝子の位置など、機能情報やその他の情報を提供します。機能注釈には、他の注釈よりも信頼性の高いものもあれば、存在しないものもあります。遺伝子注釈データベースは定期的に変更され、さまざまなデータベースが同じタンパク質を異なる名前で参照しており、タンパク質機能に関する理解の変化を反映しています。標準化された遺伝子命名法を使用すると、命名の問題に対処するのに役立ちますが、転写産物と遺伝子の正確な一致^{[18] [19]}は依然として重要な考慮事項です。

調節遺伝子のセットを特定したら、発現プロファイリングの次のステップでは、調節セット内のパターンを探します。これらの遺伝子から生成されるタンパク質は、同様の機能を果たしますか? 化学的に類似していますか? 細胞の同様の部分に存在しますか? 遺伝子オントロジー分析は、これらの関係を定義する標準的な方法を提供します。遺伝子オントロジーは、非常に広範なカテゴリ (例: 「代謝プロセス」) から始まり、より小さなカテゴリ (例: 「炭水化物代謝プロセス」) に細分化され、最終的には「イノシトールおよび誘導体のリン酸化」などの非常に限定されたカテゴリに細分化されます。

遺伝子には、生物学的機能、化学的性質、細胞内の位置以外にもさまざまな属性があります。遺伝子セットは、他の遺伝子との近さ、病気との関連性、薬物や毒素との関係に基づいて構成することができます。分子シグネチャデータベース^[20]や比較毒性ゲノムデータベース^[21]は、さまざまな方法で遺伝子を分類するためのリソースの例です。

調節遺伝子は、それが何であるか、何をするかという観点から分類され、遺伝子間の重要な関係が浮かび上がることがあります。^[23]たとえば、ある遺伝子がタンパク質を作り、その酵素がタンパク質を活性化して、リストにある 2 番目の遺伝子をオンにするという証拠が見られるかもしれません。この 2 番目の遺伝子は、リストにあるさらに別の遺伝子を調節する転写因子である可能性があります。これらのリンクを観察すると、結果の関連性は単なる偶然ではなく、基礎にある生物学的プロセスのためにすべてがリストにあるのではないかと疑い始めるかもしれません。一方、遺伝子をランダムに選択すると、共通点があると思われる遺伝子が多数見つかる可能性があります。この意味で、出現している生物学的テーマが重要かどうかをテストするには、厳密な統計的手順が必要です。ここで、遺伝子セット分析^{[16] [17]}の出番です。

かなり単純な統計により、リスト上の遺伝子間の関連性が偶然によって予想されるものより大きいかどうかを推定できます。これらの統計は、実際に起こっていることを大幅に単純化しすぎているとしても、興味深いものです。例を挙げましょう。実験に 10,000 個の遺伝子があり、そのうち 50 個 (0.5%) のみがコレステロールの生成に既知の役割を果たしているとします。実験では 200 個の調節遺伝子が特定されました。そのうち 40 個 (20%) はコレステロール遺伝子のリストにも載っています。コレステロール遺伝子の全体的な普及率 (0.5%) に基づくと、平均して 200 個の調節遺伝子ごとに 1 個のコレステロール遺伝子、つまり 200 の 0.005 倍が予想されます。この予想は平均であるため、複数の遺伝子が見つかることもあります。問題は、純粋な偶然により 1 個ではなく 40 個が見つかる頻度がどのくらいかということです。

超幾何分布によれば、10,000個の遺伝子の中からランダムに200個の遺伝子を抽出して39個以上のコレステロール遺伝子を選ぶまでに、約10^57回（10の後に56個のゼロが続く）試行する必要があることが予想される。偶然にこれを観察する確率がいかに小さいかに注意を払うかどうかにかかわらず、調節遺伝子リストにはコレステロールとの関連性が知られている遺伝子が豊富に含まれ^[24]ていると結論付けられるだろう。

さらに、実験的治療はコレステロールを制御するという仮説を立てることもできる。なぜなら、治療はコレステロールに関連する遺伝子を選択的に制御しているように見えるからである。これは真実かもしれないが、エンリッチメントのみに基づいてこれを確固とした結論にするのは不当な飛躍を意味する理由はいくつかある。前述の問題の 1 つは、遺伝子制御がタンパク質制御に直接影響を及ぼさない可能性があるという観察と関係している。これらの遺伝子によってコード化されたタンパク質がコレステロールを生成すること以外何もしないとしても、それらの mRNA が変化したことを示すことは、タンパク質レベルで何が起こっているかを直接教えてくれるわけではない。実験条件下では、これらのコレステロール関連タンパク質の量が一定のままである可​​能性は十分にある。第 2 に、たとえタンパク質レベルが変化する場合であっても、おそらく、コレステロールを可能な限り速く生成するのに十分なタンパク質が常に存在する。つまり、リストにない別のタンパク質が、コレステロール生成プロセスの速度決定ステップである。最後に、タンパク質は通常多くの役割を果たすため、これらの遺伝子は、コレステロール生成との共通した関連性のためではなく、完全に独立したプロセスにおける共通の役割のために制御される可能性がある。

前述の注意事項を念頭に置くと、遺伝子プロファイル自体は治療法と生物学的効果の因果関係を証明するものではありませんが、他の方法では到達するのが非常に難しいことが多い独自の生物学的洞察を提供します。

上で説明したように、まず有意に調節されている遺伝子を特定し、次に有意な遺伝子のリストを、特定の関連性があることがわかっている遺伝子のセットと比較することによってパターンを見つけることができます。問題を逆の順序で処理することもできます。非常に簡単な例を挙げましょう。既知のプロセス、たとえば糖尿病の素因に関連する遺伝子が 40 個あるとします。高炭水化物食を与えられたマウスと低炭水化物食を与えられたマウスの 2 つのグループの発現プロファイルを見ると、40 個の糖尿病遺伝子すべてが、低炭水化物グループよりも高炭水化物グループで高いレベルで発現していることがわかります。これらの遺伝子のいずれかが有意に変化した遺伝子のリストに含まれるかどうかに関係なく、40 個すべてが上昇し、下降がまったくないことが純粋な偶然の結果である可能性は低いようです。公平なコインを使用して 40 回連続で表が出ることは、1 兆回に 1 回程度発生すると予測されます。

ある種の細胞では、組み合わされた発現パターンが特定の病状に特有の遺伝子のグループが、この病状の遺伝子シグネチャを構成します。理想的には、遺伝子シグネチャを使用して、特定の疾患状態の患者グループを選択し、治療法の選択を容易にする精度を実現できます。 ^{[25] [26]} 遺伝子セットエンリッチメント解析（GSEA）^[16]および同様の方法^[17]は、この種のロジックを活用しますが、より高度な統計を使用します。これは、実際のプロセスの構成遺伝子は、グループとして単純に上下に移動するよりも複雑な動作を示し、遺伝子が上下に移動する方向だけでなく、その量が意味を持つためです。いずれにせよ、これらの統計は、いくつかの小さな遺伝子セットの動作が、その小さなセットに含まれない遺伝子と比較してどの程度異なるかを測定します。

GSEAはコルモゴロフ・スミルノフ型の統計を使用して、以前に定義された遺伝子セットが現在の発現プロファイルで異常な動作を示しているかどうかを確認します。これにより、複数の仮説をテストするという課題が生じますが、それに対処するための合理的な方法が存在します。^[27]

発現プロファイリングは、さまざまな条件下で遺伝子が何をするかという新しい情報を提供します。全体として、マイクロアレイ技術は信頼性の高い発現プロファイルを生成します。^[28]この情報から、生物学に関する新しい仮説を立てたり、既存の仮説をテストしたりできます。ただし、これらの実験の規模と複雑さにより、さまざまな解釈が可能になります。多くの場合、発現プロファイリングの結果を分析するには、最初の実験を実行するよりもはるかに多くの労力がかかります。

ほとんどの研究者は、発現プロファイリングの結果を発表する前に、バイオインフォマティクス専門家やDNA マイクロアレイの他の専門家と連携しながら、複数の統計的手法と探索的データ分析を使用しています。発現プロファイリング実験を成功させるには、適切な実験設計、適切な生物学的複製、およびフォローアップ実験が重要な役割を果たします。

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