マイクロRNAシーケンス

マイクロRNAシーケンス（miRNA-seq）は、次世代シーケンスまたは大規模並列ハイスループットシーケンス技術を利用して、特定のサンプル中の新規miRNAとその発現プロファイルを見つけるために開発されました。miRNAシーケンス自体は新しいアイデアではなく、初期のシーケンス方法はサンガーシーケンス法を利用していました。シーケンスの準備には、カラムとゲル電気泳動によって選択された21～25 bpサイズの内因性小型RNAから逆転写されたDNAをクローニングしてライブラリを作成することが含まれていました。^{[ 13 ]} しかし、この方法は時間とリソースの点で膨大であり、各クローンを個別に増幅してシーケンス用に準備する必要があります。この方法はまた、意図せず高発現のmiRNAを優先します。^{[ 6 ]} 次世代シーケンスは、DNAマイクロアレイ分析に必要な配列特異的ハイブリダイゼーションプローブの必要性を排除し、サンガーシーケンス法に必要な面倒なクローニング方法も不要にします。さらに、miRNA-SEQ法の次世代シーケンシングプラットフォームは、1回のシーケンシングランで大量の小さなRNAのシーケンシングを容易にします。^{[ 14 ]}

miRNA-seqは、さまざまなシーケンスプラットフォームを使用して実行できます。miRNA -seq法を使用した最初の小型RNAの解析では、Lynx TherapeuticsのMassively Parallel Signature Sequencing（MPSS）シーケンスプラットフォームを使用して、モデル植物Arabidopsis thalianaから約140万個の小型RNAを調べました。この研究は、小型RNAの研究のための新しいハイスループットシーケンス技術の可能性を示し、ゲノムが多数の小型RNAを生成し、植物が特に小型RNAの豊富な供給源であることを示しました。^{[ 15 ]}その後の研究では、他のシーケンス技術が使用され、 C. elegans の研究では、18個の新しいmiRNA遺伝子と、21U-RNAと呼ばれる新しいクラスの線虫小型RNAが特定されました。^{[ 16 ]} ヒト子宮頸部腫瘍と正常組織の小型RNAプロファイルを比較した別の研究では、Illumina (社) Genome Analyzerを使用して、64個の新規ヒトmiRNA遺伝子と67個の差次的発現miRNAを同定しました。^{[ 17 ]} Applied Biosystems SOLiDシーケンスプラットフォームも、ヒト乳がんの検出におけるmiRNAの予後価値を調べるために使用されています。^{[ 18 ]}

シーケンスライブラリーの構築は、使用するハイスループットシーケンスプラットフォームに応じて、さまざまなキットを使用して実行できます。ただし、小型RNAシーケンスの準備にはいくつかの共通のステップがあります。^{[ 19 ] [ 20 ]}

全RNAの分離

特定のサンプルでは、​​イソチオシアネート/フェノール/クロロホルム（GITC/フェノール）法またはTrizol（ Invitrogen）試薬などの市販製品を使用して、すべてのRNAが抽出および分離されます。ゲル精製およびサイズ選択には、通常、総RNA 50～100 μg（1 gの組織からは通常 、総RNA 1 mgが得られます）の開始量が必要です。^{[ 20 ]} RNAの品質管理も測定され、たとえばCaliper LabChipGX（ Caliper Life Sciences ） でRNAチップを実行します。

ゲル電気泳動による小型RNAのサイズ分画

単離したRNAを変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動する。放射性5'-32P標識オリゴヌクレオチドなどのイメージング法とサイズラダーを用いて、適切なサイズのRNAを含むゲルのセクションを特定し、最終的に配列決定する材料の量を減らす。このステップは、後述するライゲーションおよび逆転写ステップの前に必ずしも行う必要はない。^{[ 19 ] [ 20 ]}

結紮

ライゲーションステップでは、逆転写およびPCR増幅中にプライマー結合部位として機能するDNAアダプターを、小RNAの両端に付加します。アデニル化された一本鎖DNA 3'アダプターとそれに続く5'アダプターは、T4 RNAリガーゼ2などのライゲーション酵素を使用して小RNAにライゲーションされます。アダプターは、5'ヒドロキシル基を持つRNA分解産物ではなく、5'リン酸基を持つマイクロRNAを捕捉するように設計されています。^{[ 19 ] [ 20 ]}

逆転写とPCR増幅

このステップでは、小さなアダプターが連結されたRNAを、シーケンス反応で使用するcDNAクローンに変換します。このステップを実行する市販のキットは多数あり、何らかの逆転写酵素を使用します。次にPCRを実行して、cDNA配列のプールを増幅します。このステップでは、独自のヌクレオチドタグで設計されたプライマーを使用して、プールされたライブラリーのマルチプレックスシーケンスでIDタグを作成することもできます。^{[ 19 ] [ 20 ]}

実際のRNAシーケンスは、使用するプラットフォームによって大きく異なります。一般的な次世代シーケンス^{[ 21 ]}プラットフォームは、 454 Life Sciencesプラットフォームでのパイロシーケンス^{[ 22 ]} 、 Illumina（会社）プラットフォームでのポリメラーゼベースのシーケンスバイシンセシス^{[ 23 ]} 、またはABI Solid Sequencingプラットフォームでのライゲーションによるシーケンス^{[ 24 ]}の3つです。

miRNAは、特定の細胞型、組織、発生段階、または癌などの特定の疾患状態で優先的に発現する可能性があります。^{[ 1 ]} ディープシーケンシング（miRNA-seq）は、特定のサンプルから数百万のリードを生成するため、miRNAのプロファイリングが可能になります。これは、絶対存在量を定量化することによって、またはそのバリアント（アイソミールとして知られています^{[ 25 ]}）を発見することによって行われます。シーケンスリードの平均長は平均的なmiRNA（17～25 nt）よりも長いため、miRNAの3'末端と5'末端は同じリードで見つかるはずです。miRNA存在量の定量化アルゴリズムはいくつかあります。^{[ 21 ] [ 26 ]}それらの一般的な手順は次のとおりです。^{[ 27 ]}

1. シーケンス解析後、生のシーケンスデータは品質に基づいてフィルタリングされます。また、アダプター配列も生のシーケンスデータから除去されます。
2. 得られたリードデータは、各固有タグのコピー数と配列が記録されたfastaファイルにフォーマットされます。
3. 大腸菌汚染の可能性を示す配列は、大腸菌データベースに対するBLAST検索によって特定され、解析から除外される。
4. 残りの各配列は、miRNA配列データベース（miRBase ^{[ 28 ]}など）に対してアラインメントされます。不完全なDICER処理を考慮するため、3'末端に6nt、5'末端に3ntのオーバーハングが許容されます。
5. miRNAデータベースにアラインメントされないリードは、miRNA前駆体に緩やかにアラインメントされ、変異を持つ可能性のあるmiRNAやRNA編集を受けたmiRNAが検出される。
6. 各miRNAのリードカウントは、マッピングされたmiRNAの総数で正規化され、各miRNAの存在量が報告される。

miRNA-seqのもう1つの利点は、従来のスクリーニングやプロファイリング方法では見逃されていた可能性のある新規miRNAの発見を可能にすることです。^{[ 27 ]}いくつかの新しいmiRNA発見アルゴリズムがあります。それらの一般的な手順は次のとおりです。

1. 既知のmiRNA配列にアラインメントされなかったリードを取得し、それらをゲノムにマッピングする。
2. RNA折り畳み方法
   1. 完全に一致するmiRNA配列が見つかった場合は、両側の約100bpの隣接配列を含むゲノム配列を取得し、ViennaパッケージなどのRNAフォールディングソフトウェアでRNAを実行します。^{[ 29 ]}
   2. miRNAヘアピンの片方の腕に位置し、最小自由エネルギーが約25kcal/mol未満の折り畳まれた配列は、推定miRNAとして候補に挙げられる。
   3. 最終候補に残った配列は、可能性のある前駆体配列のみを含むように絞り込まれ、その後、前駆体が隣接する配列によって人為的に安定化されていないことを確認するために再折り畳みされます。
   4. 結果として生じる折り畳まれた配列は、miRNA配列がヘアピンの片方の腕の範囲内に収まり、種間で高度に保存されている場合、新規miRNAとみなされる。
3. スターストランド発現法（miRdeep ^{[ 30 ]}）
   1. 新規miRNA配列は、DICER処理によって生じる特徴的な発現パターン、すなわちスターストランドおよびループ配列よりも成熟miRNAの発現が高いという特徴に基づいて同定される。

各サンプルにおけるmiRNAの発現量を定量した後、サンプル間でその発現レベルを比較することができる。そうすることで、特定の時点、特定の組織、または疾患状態において優先的に発現するmiRNAを特定することが可能になる。サンプル間のマッピングされたリード数を正規化した後、遺伝子発現プロファイリングで使用されるような様々な統計的検定を用いて、発現差を判定することができる。

miRNAのmRNA標的を特定することで、miRNAが発現を制御する遺伝子または遺伝子ネットワークの理解が得られます。^{[ 31 ]}公開データベースはmiRNA標的の予測を提供します。しかし、真陽性予測と偽陽性予測をより適切に区別するために、miRNA-seqデータをmRNA-seqデータに統合して、miRNA:mRNA機能ペアを観察することができます。RNA22、^{[32] TargetScan、[33][34][35][36][37][38] miRanda、[ 39 ]および}PicTar [ ^{40 ]は、この目的のために設計されたソフトウェアです。}予測^{ソフトウェアのリスト}は^{ここに示さ}れています。一般的な手順は次のとおりです^。

1. miRNAとmRNAの結合ペアを決定し、mRNA配列の3'-UTRにおけるmiRNA配列間の相補性を特定する。
2. 種間におけるmiRNAとmRNAの結合ペアの保存度を決定する。一般的に、結合度の高いペアほど、予測の偽陽性となる可能性は低くなる。
3. mRNAシーケンスデータまたはタンパク質発現データにおいて、miRNAによる標的化の証拠を観察する。miRNAの発現が高い場合、その標的遺伝子の遺伝子発現およびタンパク質発現は低いはずである。

多くのmiRNAは、mRNA標的の切断を誘導する機能を持ちます。これは特に植物において顕著であり、そのため、切断または分解されたmRNAのキャップされていない3'末端をシーケンスすることにより、miRNAのこの特性を利用するハイスループットシーケンス法が開発されました。これらの方法は、デグラドームシーケンスまたはPAREとして知られています。^{[ 41 ] [ 42 ]}特定のmRNAにおける標的切断の検証は、通常、遺伝子特異的プライマーを使用した5' Rapid Amplification of cDNA Endsの改良版を使用して行われます。

miRNA-seqは、従来のmiRNAプロファイリング法では見逃されていた新規miRNAを明らかにした。このような発見の例としては、胚性幹細胞^{[ 25 ]} 、鶏胚^{[ 43 ]} 、急性リンパ芽球性白血病^{[ 44 ]} 、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫およびB細胞^{[ 45 ]} 、急性骨髄性白血病^{[ 46 ]}、肺癌^{[ 47 ]などが挙げられる。}

マイクロRNAは、生存、増殖、分化など、ほぼすべての細胞プロセスの重要な調節因子です。したがって、miRNAが癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子の発現調節を介して癌のさまざまな側面に関与していることは驚くべきことではありません。ハイスループットプロファイリング法の開発と相まって、miRNAは癌の分類、治療への反応、および予後のバイオマーカーとして同定されています。^{[ 48 ]}さらに、miRNAは遺伝子発現を調節するため、特定の疾患を引き起こしている可能性のある重要な調節ネットワークの摂動も明らかにすることができます。^{[ 48 ]} 以下に、バイオマーカーおよび疾患予測因子としてのmiRNAのいくつかの応用例を示します。

^αこれは、これらの悪性腫瘍に関与するmiRNAの包括的なリストではありません。

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