シングルドメイン抗体

シングルドメイン抗体（sdAb ）はナノボディとも呼ばれ、単一のモノマー可変抗体ドメインからなる抗体フラグメントです。抗体全体と同様に、特定の抗原に選択的に結合できます。分子量がわずか12～15 kDaのシングルドメイン抗体は、2つの重タンパク質鎖と2つの軽鎖からなる一般的な抗体（150～160 kDa）よりもはるかに小さく、Fabフラグメント（約50 kDa、1つの軽鎖と半分の重鎖）やシングルチェーン可変フラグメント（約25 kDa、2つの可変ドメイン、1つは軽鎖から、もう1つは重鎖から）よりもさらに小さくなっています。^[1]

最初のシングルドメイン抗体はラクダ科動物に見られる重鎖抗体から作られ、これらはV _​​H Hフラグメントと呼ばれています。軟骨魚類にも重鎖抗体（IgNAR、「免疫グロブリン新抗原受容体」）があり、そこからV _NARフラグメントと呼ばれるシングルドメイン抗体が得られます。^[2]別のアプローチは、ヒトまたはマウスの一般的な免疫グロブリンG （IgG）の二量体可変ドメインをモノマーに分割することです。現在、シングルドメイン抗体の研究のほとんどは重鎖可変ドメインに基づいていますが、軽鎖から派生したナノボディも標的エピトープに特異的に結合することが示されています。^[3]

ラクダ科動物のナノボディは抗体と同等の特異性があり、場合によっては抗体よりも堅牢であることが示されています。抗体に使用されるのと同じファージパンニング手順を使用して簡単に分離できるため、高濃度で試験管内で培養できます。サイズが小さくドメインが単一であるため、これらの抗体は細菌細胞に変換して大量生産しやすく、研究目的に最適です。^[4]

シングルドメイン抗体は、複数の医薬品への応用について研究されており、急性冠症候群、癌、アルツハイマー病^{[5] [6]}、およびCovid-19 ^{[7] [8] [9]}の治療に使用できる可能性があります。

シングルドメイン抗体は、約110アミノ酸長のペプチド鎖で、重鎖抗体または一般的なIgGの1つの可変ドメイン（V _{H ）で構成されています。これらのペプチドは、全抗体と同様の抗原親和性を持っていますが、より耐熱性があり、}洗剤や高濃度の尿素に対して安定しています。ラクダ科動物や魚類の抗体に由来するものは、通常は軽鎖に結合する親油性部位を覆う拡張ループ（上のリボン図のオレンジ色）を形成する相補性決定領域3 （CDR3）により、親油性が低く、水への溶解性が高くなっています。 ^{[10] [11]}一般的な抗体とは対照的に、1999年の研究では、6つのシングルドメイン抗体のうち2つが、抗原に結合する能力を失うことなく、90 °C（194 °F）の温度に耐えました。^[12]胃酸とプロテアーゼに対する安定性は、アミノ酸配列によって異なります。いくつかの種は経口投与後に腸内で活性を示すことが示されているが^{[13] [14] 、腸からの}吸収が低いため、経口投与された全身活性の単一ドメイン抗体の開発が妨げられている。

比較的分子量が小さいため、組織内での浸透性は良好で、腎臓から排泄されるため血漿半減期は短くなります。^[1]全抗体とは異なり、Fc領域がないため、補体系によって引き起こされる細胞毒性は示しません。ラクダ科動物や魚類由来のsdAbsは、全抗体ではアクセスできない隠れた抗原、たとえば酵素の活性部位に結合することができます。^[15]この特性は、そのような埋もれた部位に浸透できる拡張されたCDR3ループに起因することが示されています。^{[11] [16] [15]}

単一ドメイン抗体は、ヒトコブラクダ、ラクダ、ラマ、アルパカ、サメを目的の抗原で免疫し、続いて重鎖抗体の可変領域（V _NARおよび V _{H H）をコードする}mRNAを単離することによって得ることができる。大きなファージディスプレイ V _NARおよび V _H H 単一ドメインライブラリは、コガラクジラ^[17]およびヒトコブラクダから確立された。^{[18] [19]}ファージディスプレイやリボソームディスプレイなどのスクリーニング技術は、抗原に結合するクローンの同定に役立つ。^{[20] [17] [21] [18] [22] [8] [19] V} _NARを含む単一ドメイン抗体は、臨床応用のためにヒト化することができる。^[23]

あるいは、シングルドメイン抗体は、4つの鎖を持つ一般的なマウス^[24] 、ウサギ^[25]、またはヒトIgG ^{[26]から作成できます。 [27]}そのプロセスは似ており、免疫化されたドナーまたは未処置のドナーからの遺伝子ライブラリーと、最も特異的な抗原を識別するためのディスプレイ技術で構成されています。 このアプローチの問題点は、一般的なIgGの結合領域が2つのドメイン（V _HとV _L）で構成されており、親油性のために二量体化または凝集する傾向があることです。 モノマー化は通常、親油性アミノ酸を親水性アミノ酸に置き換えることによって達成されますが、抗原に対する親和性が失われることがよくあります。 ^[28]親和性を維持できれば、シングルドメイン抗体は同様に大腸菌^[25]、^{[26] [29]、} S. cerevisiae、またはその他の生物で生成できます。

ヒトは、軽鎖に終止コドンをランダムに生成することで、単一ドメイン抗体を産生することがあります。メソテリン^[29] 、 GPC2 ^[30]、GPC3 ^{[26] [31]}などのさまざまな腫瘍抗原を標的とするヒト単一ドメイン抗体がファージディスプレイによって単離されました。HN3ヒト単一ドメイン抗体は、肝臓がんの治療のための免疫毒素^{[31] [32] [33]}やキメラ抗原受容体（CAR）T細胞^[34]の作成に使用されています。HN3ヒト単一ドメイン抗体によってGPC3のWnt結合ドメインをブロックすると、肝臓がん細胞におけるWnt活性化が阻害されます。^[35]

シングルドメイン抗体は、その小型、簡単な製造、高い親和性により、バイオテクノロジーや治療用途において幅広い用途に使用可能である。^{[36] [37] [15]}

蛍光タンパク質をナノボディに融合すると、いわゆるクロモボディが生成されます。クロモボディは、生細胞のさまざまなコンパートメント内のターゲットを認識して追跡するために使用できます。そのため、生細胞顕微鏡検査の可能性が高まり、新しい機能研究が可能になります。^[38]抗GFPナノボディを GFP ナノトラップと呼ばれる一価マトリックスに結合すると、GFP 融合タンパク質とその相互作用パートナーを分離して、さらに生化学分析を行うことができます。^[39]超解像イメージング技術による単一分子の局在化には、蛍光体をターゲットタンパク質の近くに特異的に送達する必要があります。有機染料に結合した抗体はサイズが大きいため、蛍光体とターゲットタンパク質の間の距離が原因で、誤った信号が発生することがよくあります。GFP タグ付きタンパク質をターゲットとする抗 GFP ナノボディに有機染料を融合すると、サイズが小さく親和性が高いため、ナノメートルの空間分解能と最小限のリンクエラーが可能になります。^[40]ナノボディのサイズの優位性は、相関光電子顕微鏡研究にも有益である。透過剤を一切使用せずに、化学的に固定された細胞の細胞質は、蛍光標識ナノボディに容易にアクセスできる。また、ナノボディはサイズが小さいため、通常の抗体よりも体積サンプルの奥深くまで浸透することができる。蛍光顕微鏡と電子顕微鏡で画像化された組織では、高い超微細構造品質が維持される。これは、分子標識と電子顕微鏡画像化の両方を必要とする神経科学研究に特に有用である。^[41]

診断バイオセンサーの用途では、ナノボディは将来的にツールとして使用される可能性があります。ナノボディはサイズが小さいため、バイオセンサー表面に高密度に結合できます。アクセスしにくいエピトープを標的にできるという利点に加えて、ナノボディの立体構造の安定性により、表面再生条件に対する耐性も高まります。ヒト前立腺特異抗原(hPSA) を感知するセンサー表面に単一ドメイン抗体を固定化した後、ナノボディがテストされました。ナノボディは、臨床的に有意な濃度の hPSA を検出する点で従来の抗体よりも優れていました。^[42]

標的分子の結晶化確率を高めるために、ナノボディを結晶化シャペロンとして使用することができます。補助タンパク質として、ナノボディはコンフォメーション状態のサブセットのみに結合して安定化させることで、コンフォメーションの不均一性を低減することができます。また、結晶化を妨げる表面をマスクしながら、結晶接触を形成する領域を拡張することもできます。^{[43] [37]}

シングルドメイン抗体は、複数の標的に対する新しい治療ツールとしてテストされています。インフルエンザAウイルスサブタイプH5N1に感染したマウスでは、ヘマグルチニンを標的としたナノボディが、体内でのH5N1ウイルスの複製を抑制し、罹患率と死亡率を低下させました。^[44]クロストリディオイデス・ディフィシルの毒性因子である毒素Aと毒素Bの細胞受容体結合ドメインを標的とするナノボディは、 in vitroで線維芽細胞における細胞変性効果を中和することが示されました。^[45]抗原提示細胞を認識するナノボディコンジュゲートは、腫瘍検出^[46]や、強力な免疫応答を生成するための標的抗原送達に効果的に使用されています。^[47]

子豚の大腸菌誘発性下痢に対する経口投与可能な単一ドメイン抗体が開発され、試験に成功している。^[14]炎症性腸疾患や大腸癌などの消化管の他の疾患も、経口投与可能な単一ドメイン抗体の標的となり得る。^[48]

マラセチア・フルフルの表面タンパク質を標的とした洗剤安定性種は、フケ防止シャンプーに使用するために設計されている。^[10]

光熱療法のアプローチとして、乳がん細胞と卵巣がん細胞で過剰発現しているHER2抗原に結合するナノボディを分岐金ナノ粒子に結合させた（図参照）。試験環境でレーザーを使用して腫瘍細胞を光熱的に破壊した。^[49]

フォン・ヴィレブランド因子を標的とする単一ドメイン抗体であるカプラシズマブは、急性冠症候群患者の血栓症予防を目的とした臨床試験が行われている。 ^{[50]高リスク経}皮冠動脈介入におけるALX-0081を検討する第II相試験は2009年9月に開始された。^[51]

アブリンクスは、ナノボディが血液脳関門を通過し、抗体全体よりも容易に大きな固形腫瘍に浸透し、脳腫瘍に対する薬の開発を可能にすると期待している。^[48]

ベータコロナウイルス（ COVID-19を引き起こすSARS-CoV-2を含む）のスパイクタンパク質のRBDドメインにしっかりと結合し、スパイクと細胞受容体ACE2との相互作用を阻害するナノボディが最近特定されました^{[52] [18]}

様々な高病原性ヒトコロナウイルス（HPhCoV）による感染の予防と治療のための様々な単一ドメイン抗体（ナノボディ）の応用が報告されている。SARS-CoV-2および類似ウイルスに結合して中和するためのナノボディの展開の見通し、効力、課題が最近注目されている。^[53]

ナガナの最も一般的な原因の1つであるトリパノソーマ・ブルーセイは、 sdAbsの標的となり得る。Stijlemansらは2004年に、ファージを用いて脊椎動物の免疫系に可変表面糖タンパク質抗原を提示することで、ウサギとラクダから効果的なsdAbsを誘導することに成功した。将来的には、これらの治療法は、自然抗体のサイズが大きいために現在は到達できない場所に到達することで、自然抗体を上回るものとなるだろう。^[54]

• 今月の分子:タンパク質データバンクのナノボディ