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ミエリン様オルガノイドまたはミエリンオルガノイドは、ヒト多能性幹細胞（hPSC）から誘導された3次元のin vitro培養モデルであり、ヒト胎児の初期発生における様々な脳領域、脊髄、または末梢神経系を再現します。 [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]ミエリン様オルガノイドは、脳の発達過程、微小環境、細胞間相互作用、構造組織、および細胞構成の側面を再現する能力を有しています。[ 2 ] [ 3 ]オルガノイドが脳オルガノイド/脳オルガノイドまたはミエリン様オルガノイドとみなされるかどうかを決定する違いは、ミエリン様オルガノイドの特徴であるミエリン化および緻密なミエリン形成の存在です。ヒトの脳は複雑な性質を持つため、複雑な生物学的プロセスを忠実に模倣できるモデルシステムが必要です。ミエリン様オルガノイドは、ミエリン病理、神経変性疾患、発達過程、および治療スクリーニングを実施できる独自のin vitroモデルを提供します。 [ 1 ] [ 2 ]
試験管内モデルは、多くの生物学的研究において重要な要素となってきた。単層培養、すなわち2D培養はこれまで広く用いられてきたが、複雑性に欠け、生体内で起こる生物学的プロセスに関わる組織構造を再現できないという限界がある。[ 4 ]マウス、線虫、ショウジョウバエ、酵母などのモデル生物は、2D単層培養よりも生物学的複雑性をよりよく再現する。[ 5 ] [ 6 ]しかし、これらのモデル生物はヒトの生物学を完全に捉えているわけではない。特に、マウスとヒトの脳の発達には大きな違いがある。主な発達上の違いとしては、神経幹細胞の分裂パターンのばらつきや、特定の発達段階で生じるグリア細胞の局在と種類などが挙げられる。[ 7 ] [ 8 ]
多能性幹細胞技術を活用し、ヒト特有の脳の発達と病理を試験管内で研究するためのモデルシステムのギャップを埋めるために、脳オルガノイドと大脳オルガノイドが開発されました。最初の大脳オルガノイドは2013年に確立されました。 [ 9 ]それ以来、小脳[ 10 ]、海馬[ 11 ] 、中脳[ 12 ]、前脳[ 13 ]、視床下部[ 14 ]オルガノイドなど、さまざまな脳領域のオルガノイドを生成するためのさまざまなプロトコルが登場しました。大脳オルガノイドは、疾患、発達、治療法を研究できる神経学的モデルを提供します。[ 15 ]しかし、大脳オルガノイドの大きな制約は、強力なミエリン形成が欠けているため、白質を調査する研究にはあまり適していないことです。
脳オルガノイドのこの限界は、2018年にミエリン形成オリゴデンドロサイトの強力な集団を含む脳オルガノイドが生成されたことで対処されました。これらのミエリン脳オルガノイドを生成するプロセスは210日間続き、特定の時点でさまざまな成長因子と培地の添加が含まれていました。[ 2 ] 2018年のプロトコルの期間が長かったため、これらのミエリンオルガノイドの分化と生成を加速および合理化する試みがありました。添加する成長因子と培地交換のタイミングがわずかに異なる同様のプロトコルが2019年に記述されました。このプロトコルは、160日目までにコンパクトなミエリン形成を持つオルガノイドを生成することができました。[ 16 ]
2019年に開発された別のプロトコルでは、有髄オルガノイドの生成をさらに加速できることが実証されました。新しいプロトコルを使用すると、中枢神経系におけるオリゴデンドロサイトの分化と髄鞘形成のマーカーであるミエリン塩基性タンパク質（MBP）が63日目（9週間）という早い時期に検出され、105日目（15週間）までに有髄軸索が観察され、プロトコルの期間が実質的に半分になりました。[ 17 ] [ 18 ]
同様の期間のプロトコルが2021年に確立されましたが、結果として得られるオルガノイドは生物学的文脈において若干異なります。このプロトコルは、脊髄のミエリン化が皮質のミエリン化よりも先に観察されるという事実を利用しました。[ 1 ]このプロトコルは、腹側尾部細胞の運命を持つ強力なミエリン化を持つオルガノイドを生成しました。[ 1 ]これらのオルガノイドは、厳密には脳オルガノイドではありませんが、ミエリン疾患の病理を研究するためにも使用でき、 Nfasc 155-/- 患者で観察される疾患病理を再現するオルガノイドを生成することによって、この研究で検証されました。このプロトコルでは、ミエリン化されたオルガノイドを「ミエリン様オルガノイド」と呼び、ミエリン様オルガノイドと呼ばれるオルガノイドのカテゴリーを作成しました。[ 1 ]
2021年、研究者グループは、長期間にわたる分化プロトコルによってミエリン様細胞が薬剤スクリーニングなどのハイスループット実験には実用的でないという事実に対処することを目指しました。[ 19 ]そのため、科学者たちは、オリゴデンドログリア遺伝子の早期発現に依存するヒト誘導多能性幹細胞（hiPSC）株を開発し、わずか42日でミエリン様オルガノイドの迅速な生成を可能にしました。 [ 19 ]現在までに、これは脳オルガノイドで成熟オリゴデンドロサイトを生成する最速のプロトコルです。[ 19 ]
オルガノイドを生成するために、ヒト多能性幹細胞（hPSC）を低接着プレート（浮遊状態）で胚様体（EB）に凝集させ、その後、細胞増殖、成長、分化を促進する系統特異的因子を含む回転式バイオリアクターで培養します。 [ 2 ] [ 20 ] [ 21 ] EBは、中胚葉、内胚葉、外胚葉のすべての胚葉に分化する能力を持っています。生体内では、ミエリンを含む神経系は外胚葉から生成されます。[ 21 ]これを試験管内で再現してミエリンオルガノイドを生成するために、EBは、外胚葉分化を特異的に誘導する特定の成長因子とサプリメントを含む培地で培養され、その後、神経誘導が行われます。[ 21 ]より具体的には、神経誘導因子が添加され、神経前駆細胞の形成が誘導され、それが生体内で神経細胞やオリゴデンドロサイトを含むグリア細胞を生み出す。[ 2 ]
hPSCを神経細胞に効率的に分化させる確立された方法は、ドロソモルフィン（化合物Cとしても知られる）とSB431542を用いたSMADシグナル伝達の二重阻害である。 [ 1 ] [ 2 ] [ 22 ] [ 23 ]神経前駆細胞のさらなる増殖を促進するために、上皮成長因子（EGF）や線維芽細胞成長因子2（FGF-2）などの特定の成長因子が培地に添加される。 [ 2 ] [ 23 ] [ 24 ]神経およびグリア誘導の前に、スフェロイドは一般的にマトリゲルなどの細胞外マトリックスに埋め込まれ、回転バイオリアクターに移され、そこでさまざまな小分子と成長因子が継続的に補充され、細胞が特定の構造と細胞型に分化するように促進される。[ 2 ] [ 20 ] [ 23 ]
生体内では、神経誘導がオリゴデンドロサイト形成に先行する。[ 25 ]したがって、培養では、まず神経誘導因子を添加してスフェロイドの神経皮質パターンを誘導し、次にオリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）の形成とオリゴデンドログリアへの分化を誘導する因子を添加する。[ 2 ] [ 23 ]神経前駆細胞からの神経形成を促進するために、脳由来神経栄養因子（BDNF）と神経栄養因子3（NT3）を培地に添加することができる。[ 2 ] [ 23 ]その後、血小板由来成長因子AA（PDGF-AA）やインスリン様成長因子1 （IGF-1）などの因子を培地に添加して、OPCの増殖と生存を促進することにより、オルガノイド内に存在するOPC集団の拡大をもたらす。[ 1 ] [ 2 ]
最後に、OPCをオリゴデンドロサイトに分化させ、最終的にミエリン形成オリゴデンドロサイトにする因子が添加されます。[ 1 ] [ 2 ]これには、生体内でOPCからオリゴデンドロサイトの生成を誘導することが示されている甲状腺ホルモン（T3）が含まれます。 [ 1 ] [ 2 ]オルガノイドは、分析が必要になるまで浮遊状態で維持され、そこで成長および成熟します。このワークフローの基本は、一般的にミエリンオルガノイドを取得するために使用されますが、これに依存するさまざまなプロトコルでは、さまざまな目的のために複数の変更が導入されています。Madhavanらは、堅牢なOPCおよびオリゴデンドロサイト集団、したがってミエリン形成を伴うオルガノイドを生成できる再現性のあるプロトコルを最初に確立しました。これらはミエリンオルガノイド、またはミエリン様オルガノイドと呼ばれます。[ 2 ]
ミエリンオルガノイドの生成は一般的に、分化プロトコルの後半でオリゴデンドロサイト形成を誘導するために必要な構造的および細胞的枠組みを確立する神経皮質パターン形成因子に依存している。[ 2 ]したがって、分化の初期段階におけるミエリンオルガノイドの特性と構成要素は、神経前駆細胞、ニューロンおよびグリア細胞の前駆細胞集団が出現し、初期胚発生中の皮質の特徴を再現する明確な層に自己組織化を開始する脳オルガノイドで観察されるものと非常によく似ている。[ 3 ]
このような初期段階では、ミエリンオルガノイドは、脳室を模した液体で満たされた空洞を囲む大きな連続した神経上皮を形成し始めます。[ 9 ]推定される脳室を取り囲む前駆細胞は、オルガノイドが成熟するにつれてより明確になる特定の神経マーカーによって定義される明確な層に組織化されます。[ 9 ]これらの層には、PAX6、SOX2、Ki67を発現する細胞を含む空洞を取り囲む脳室帯、それに続くKi-67とTBR2を発現する細胞を含む外側の脳室下帯と中間帯、そして最後にCTIP2、MAP2、TBR1を発現する細胞を含む皮質板層が含まれます。[ 3 ]
神経皮質のパターン形成後、オリゴデンドロサイト系統の成長因子が、分布するオリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）の固有集団の拡大を促進し、グリア誘導およびOPC特異化のマーカーであるSOX6、SOX10、およびOLIG2を発現する細胞数を大幅に増加させます。[ 2 ]ミエリンオルガノイドが成熟するにつれて、OPC細胞は、ミエリンの主要成分であるプロテオリピドタンパク質1（PLP1 ）とオリゴデンドロサイト特異的転写因子であるMYRF25を発現するオリゴデンドロサイトに分化します。[ 2 ]オリゴデンドロサイトは神経層全体に分布しており、成熟すると、その突起はMBPとCNP（初期ミエリン化マーカー）を発現し、周囲の軸索を包み込んでミエリン化し始めます。ミエリンは成熟、精製、圧縮を経て、最終的にコンパクトに包まれたミエリン層を持つ機能的な神経ネットワークが形成されます。[ 1 ] [ 2 ]さらなるミエリン成熟により、傍節軸索グリア接合部（PNJ）とランヴィエ結節を有する明確な軸索サブドメインが形成される。傍節および結節アセンブリの観察はプロトコルに依存し、傍節および結節アセンブリが観察される場合と観察されない場合がある。全体として、ミエリンオルガノイドのオリゴデンドロサイトは、神経軸索を包み込んで組織化するコンパクトなミエリンを形成し、ヒトの有髄軸索ネットワークの三次元構造を再現する能力を示す。
ミエリノイドは脳の発達とミエリン形成のさまざまな基本的な側面を再現し、それゆえ関連する疾患や病理を再現します。そのため、神経変性疾患、CNS損傷、PMD、NFASCなど、ミエリン欠損に関連するさまざまな疾患をモデル化し、疾患メカニズムを理解するために使用できます。[ 1 ] [ 2 ] [ 17 ]
PMDは、 X連鎖プロテオリピドタンパク質1遺伝子（PLP1）の様々な変異によって引き起こされる稀な単一遺伝子疾患です。 [ 26 ] PLP1はミエリン形成に不可欠なタンパク質です。PMDは白質ジストロフィーに分類され、脳の白質に影響を与える疾患です。Madhavanらは、ミエリン様システムがPMDの確立された細胞病理をどの程度再現できるかを検証しました。オルガノイドは、疾患の重症度が異なる3人の患者から採取され、欠失、重複、点変異を持つ被験者はそれぞれ軽度、中等度、重度の表現型を示しました。[ 2 ]彼らの研究結果は、生成されたミエリン形成オリゴコルティクスフェロイドが遺伝子変異に関連する細胞病理の程度を再現することを示しており、したがって、まだ十分に特徴付けられていない PMD 遺伝子型と表現型の間の関係を理解するためのモデルとして役立つ可能性がある。[ 2 ]
NFASC遺伝子は、神経突起の伸長と束形成に関与する細胞接着分子をコードしています。[ 27 ]さらに、NFASCは、発生過程における軸索開始セグメントとランヴィエ絞輪の組織化に関与しています。[ 27 ] NFASCにナンセンス変異を持つ患者は、傍節軸索グリア接合部（PNJ）に異常があります。[ 1 ] Jamesらは、患者由来のミエリン様物質では、患者と対照の両方のミエリン様物質が広範囲に形成されていることを実証しましたが、予想通り、患者由来のミエリン様物質のPNJでは傍節形成が阻害されていました。[ 1 ]
ミエリンの構造と完全性は、ヒトでは分子レベルで研究するのが本質的に困難です。MRIはヒトの脳のミエリン異常を明らかにすることができますが、多くの研究では、遺伝子変異に対するミエリン関連の変化を研究するために動物モデルを使用しています。ミエリノイドは、ミエリン構造を研究するための 3D ヒト由来システムを提供します。[ 2 ]ミエリン鞘の数と長さ、傍節/節の組織と構造、ミエリンの体積と圧縮、細胞の同一性と構成、および細胞の組織はすべて、ミエリンの変化を定量化する方法です。[ 1 ]
研究により、ミエリンオルガノイドでは、ヒトのミエリン形成を細胞レベルとミエリンオルガノイド全体にわたって定量的に薬理学的に操作できることが示されています。[ 1 ]したがって、ミエリンオルガノイドは、ヒトの生理学的に関連する状況でミエリン関連の候補治療薬や薬剤を評価するための前臨床モデルとして使用できます。[ 2 ]
ミエリンオルガノイドは、白質ジストロフィーや多発性硬化症（中枢神経系に影響を与える自己免疫性脱髄疾患）など、脱髄に関連する疾患を持つ患者に対するミエリン化戦略の治療可能性を研究するために使用できます。 [ 2 ] [ 28 ] [ 29 ]クレマスチンとケトコナゾールは、げっ歯類モデルでオリゴデンドロサイトの生成とミエリン化を強力に刺激するミエリン化促進薬です。これらの薬の既知の効果は、ミエリンオルガノイドを使用して再現されており、オルガノイド内でオリゴデンドロサイトの生成、成熟、ミエリン化の範囲と速度を増強および加速しました。[ 2 ]
ペリツァウス・メルツバッハー病（PMD）の特定のクラスでは、プロテオリピドタンパク質1（PLP1）がオリゴデンドロサイトの核周囲に保持される。[ 30 ]ミスフォールドタンパク質の核周囲保持は、小胞体（ER）ストレスの特徴であり、PMDで観察される病態に関与している可能性がある。[ 30 ] 2018年に開発されたペリツァウス・メルツバッハー病（PMD）のミエリン様モデルでは、タンパク質キナーゼR様ERキナーゼの阻害剤であるGSK2656157と呼ばれるERストレス経路の調節剤による治療により、PLP1の核周囲保持が部分的に回復し、ERから離れてオリゴデンドロサイトの突起に移動した。[ 2 ]さらに、治療により、オリゴデンドロサイト特異的転写因子であるMYRFの発現を示す細胞数が増加した。MYRFの発現は、対照群と比較してPMDオリゴデンドロサイトで減少していることが観察されている。[ 2 ]
プロテオリピドタンパク質1（PLP1）の点変異によって引き起こされるPMDのミエリン様モデルにおいて、それを生成するために使用されるhPSCの野生型配列に対するCRISPR補正により、PMD病理のいくつかの側面が回復した。 [ 2 ]この治療により、PLP1の核周囲保持とオリゴデンドロサイト突起への移動が回復し、オリゴデンドロサイト特異的マーカーであるMYRFを発現するオリゴデンドロサイトの量が、健常対照で観察されるレベルまで増加した。[ 2 ] CRISPRによるPLP1点変異の補正後にhPSCから誘導されたミエリンオルガノイドは、20週間の培養後にミエリンを生成した。[ 2 ]
「オミクス」はオルガノイドに幅広く応用されており、オルガノイド技術の開発以来、トランスクリプトーム、エピゲノム、プロテオーム、メタボローム解析が用いられてきた。[ 31 ]さらに、オルガノイドを用いて標的遺伝子編集や宿主と微生物叢の相互作用が研究されてきた。[ 31 ]
ヒト被験者の脳の遺伝子発現パターンを研究することは不可能であるため、ヒトの脳の複雑さの一部を試験管内で再現する能力は、ヒトの発達と疾患の側面を調査することを可能にする。シングルセルオミクスは、これまで定義されていなかったマウスモデルにおけるオリゴデンドロサイト前駆細胞（OPC）と成熟オリゴデンドロサイトの異なるサブポピュレーションを同定するために使用されてきた強力なツールである。[ 32 ]オリゴデンドロサイトの不均一性は、これまで機能的に均一であると考えられていたが、特定の転写シグネチャと遺伝子オントロジープロファイルによって、異なる細胞集団を特徴付けることができる。
2018年に生成されたミエリン様細胞の単一細胞RNAシーケンス（scRNA seq）解析により、オリゴ皮質球状体の発達の複数の段階を通してオリゴデンドロサイトの明確な集団が存在し、それがヒト胎児皮質から得られた単一細胞トランスクリプトームデータとよく一致することが確認された。[ 2 ]トランスクリプトームがヒト胎児脳データと非常によく似ているため、脳オルガノイド内の細胞の制御ランドスケープは、ヒト脳の発達を制御する根本的な制御メカニズムに関する情報を提供することができる。[ 33 ]
2020年、研究者らは、脳オルガノイドから意味のあるscRNA seqを取得し、シーケンスを使用してトランスポザーゼアクセス可能なクロマチンをアッセイする（ATAC-seq）データを取得するアプローチについて説明した。[ 33 ]脳オルガノイドとミエリンオルガノイドの生物学的特徴が似ているため、このプロトコルはミエリンオルガノイドにも適用できる可能性が高い。
Orgo-seqは、オルガノイドのバルクRNA（bRNA）およびscRNAシーケンスデータを統合できるフレームワークです。[ 34 ]このプラットフォームは、オルガノイドの表現型解析に関連する課題に対処するために開発され、神経発達障害や疾患発現に関与する重要な細胞型および細胞型特異的ドライバー遺伝子を特定する能力があることが実証されています。[ 34 ]
Orgo-Seqフレームワークを用いて、3つのデータセット（ドナー由来オルガノイドのbRNA-seq、過去の研究における脳オルガノイドおよび胎児脳のscRNA-seqデータ、およびヒト死後脳のBrainSpanプロジェクトのbRNA-seq）を使用して、自閉症スペクトラム障害におけるコピー数変異を研究した。彼らは複数のデータセットを活用して、患者由来オルガノイドに存在する細胞の種類と細胞特異的なドライバー遺伝子を特定した。
脳オルガノイドは、遺伝的変異とその細胞特異的プロセスへの影響、および神経発達障害や神経変性障害との関連性を研究できるヒト由来モデルとして機能します。[ 34 ]特に、ミエリン様細胞は、遺伝子変異によって阻害されるオリゴデンドロサイトにおける細胞型特異的な影響を研究するためのシステムを提供します。全体として、Orgo-Seqは、ドライバー遺伝子と神経疾患におけるそれらの役割を調査するための定量的かつ検証済みのフレームワークを提供します。[ 34 ]将来的には、Limらは、患者の正確な遺伝的背景を再現するミエリン様細胞を含むオルガノイドシステムにおいて、遺伝子ネットワークと遺伝子変異の影響を特定するための精密医療フレームワークを開発することを目指しています。[ 34 ]
ヒトの脳組織がないため、ミエリンオルガノイドはオリゴジェネシスとミエリン形成の研究に前例のない機会を提供します。[ 17 ]動物モデルはヒトの疾患の研究に価値がありますが、ヒトの脳の発達を完全に再現するものではなく、ヒトの生理学への翻訳可能性に影響を与える多くの相違点があります。[ 20 ]ミエリンオルガノイドはヒトの脳に似ているため、動物モデルとヒトの生理学の橋渡しとなるモデルとして提案されています。[ 3 ]
2次元（2D）単層オリゴデンドロサイトモデルなど、他のhPSC由来オリゴデンドロサイトシステムも確立されている。[ 2 ]しかし、2Dシステムと比較すると、ミエリンオルガノイドは、3D細胞構築、神経回路、細胞間相互作用、および全体的に生理学的に関連性の高い微小環境を含む、発達中のヒト脳の構造と機能をより忠実に再現している。[ 2 ] [ 3 ]
脳オルガノイドは脳の細胞構造と構成を形成するが、一般的に中枢神経系の髄鞘形成を担う細胞であるオリゴデンドロサイトを欠いている。[ 2 ] 2018年に開拓され、その後他の研究者によって改良されたミエリン様オルガノイドプロトコルは、ミエリンで覆われた機能的な神経ネットワークを形成する内因性ニューロンを追跡する、堅牢なOPCおよびオリゴデンドロサイト集団を有するオルガノイドを生成する再現性のある方法を提供する。[ 2 ] [ 19 ]
最後に、患者由来hPSC（誘導PSC）からミエリン様細胞を生成する能力は、オリゴデンドロサイトの発生および成熟段階における患者固有の病態生理を研究する上で大きな利点と機会を提供する。これにより、個別化された治療アプローチの開発が可能になる。[ 2 ] [ 18 ]
すべてのモデルシステムと同様に、ミエリン様細胞にも限界があります。オルガノイドの生成に関わる方法のため、実験のばらつきが大きくなる可能性があります。[ 18 ]さらに、ミエリン形成が起こる期間が長いため、ミエリン発達に関わる分子や治療法の投与量を最適化することは困難です。[ 1 ]このモデルでの薬剤スクリーニングの利点には、それなりの限界があります。プロトコルの期間が長く、効率が限られているため、ミエリン様細胞実験をハイスループットスクリーニングに適した規模に拡大することは困難です。[ 18 ]
ミエリン様組織は生体内で見られる多数の細胞型を捉えていますが、すべての細胞型を捉えているわけではありません。2021年のプロトコルで観察されたように、一部のミエリン様組織にはミクログリアが存在しません。[ 1 ]また、ミエリン様組織は行動異常を捉えていません。
最後に、すべてのオルガノイド培養における課題は、栄養素が細胞に到達するために拡散に依存していることです。そのため、多くのオルガノイドは、最も内側の細胞に栄養素が届かないために壊死中心部を発達させます。[ 35 ]最近では、血管新生オルガノイドの開発が注目されており、この問題を軽減できる可能性があります。[ 36 ]しかし、現在のプロトコルで説明されているミエリン様オルガノイドは血管新生されていません。