多座位配列タイピング

多座配列タイピング( MLST ) は、複数のハウスキーピング遺伝子の内部断片のDNA 配列を使用して複数の遺伝子座をタイピングし、微生物種の分離株を特徴付ける 分子生物学の技術です。

最初に開発されたMLSTスキームは、髄膜炎菌性髄膜炎および敗血症の原因菌である髄膜炎菌^[1]を対象としたものでした。進化史の研究のために導入されて以来、MLSTはヒト病原体だけでなく植物病原体にも使用されています。^[2]

MLST は、一連のハウスキーピング遺伝子における DNA 配列の変異を直接測定し、その固有の対立遺伝子プロファイルによって菌株を特徴付けます。MLST の原理は単純で、PCR増幅の後にDNA 配列を決定する手法です。菌株間のヌクレオチドの違いは、必要な識別レベルに応じて、さまざまな数の遺伝子で確認できます。

MLST のワークフローには、1) データ収集、2) データ分析、3) 多座配列分析が含まれます。データ収集ステップでは、遺伝子断片のヌクレオチド配列決定によって変異の決定的な識別が得られます。データ分析ステップでは、すべての固有の配列に対立遺伝子番号が割り当てられ、対立遺伝子プロファイルに結合され、配列タイプ (ST) が割り当てられます。新しい対立遺伝子と ST が見つかった場合は、検証後にデータベースに保存されます。MLST の最終分析ステップでは、対立遺伝子プロファイルを比較して分離株の関連性が決定されます。研究者は、異なるクローン複合体の ST を比較することで、疫学的および系統学的研究を行います。配列決定および識別プロセス中に膨大なデータセットが生成されるため、バイオインフォマティクス技術を使用してすべての生物学的データを整理、管理、分析、および統合します。

許容できる識別力、菌株の分類にかかる時間およびコストのバランスをとるために、研究室では一般的に約 7 ～ 8個のハウスキーピング遺伝子が使用されます。黄色ブドウ球菌を例に挙げると、MLST 分類では 7 個のハウスキーピング遺伝子が使用されます。MLST Web サイトで指定されているように、これらの遺伝子には、カルバミン酸キナーゼ( arcC ) 、シキミ酸脱水素酵素( aroE )、グリセロールキナーゼ( glpF )、グアニル酸キナーゼ( gmk )、リン酸アセチルトランスフェラーゼ( pta )、トリオースリン酸イソメラーゼ( tpi )、アセチルコエンザイム A アセチルトランスフェラーゼ( yqiL ) が含まれます。ただし、最大 10 個のハウスキーピング遺伝子が使用されることも珍しくありません。Vibrio vulnificusの場合、使用されるハウスキーピング遺伝子は、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ( glp )、DNA ジャイレース サブユニット B ( gyrB )、リンゴ酸乳酸脱水素酵素 ( mdh )、メチオニル tRNA 合成酵素( metG )、ホスホリボシルアミノイミダゾール合成酵素( purM )、トレオニン脱水素酵素( dtdS )、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素( lysA )、トランスヒドロゲナーゼ α サブユニット ( pntA )、ジヒドロオロターゼ( pyrC )、およびトリプトファナーゼ( tnaA ) です。したがって、MLST によって調べられるハウスキーピング遺伝子の数と種類は、種によって異なる場合があります。

これらのハウスキーピング遺伝子のそれぞれについて、異なる配列が対立遺伝子として割り当てられ、遺伝子座の対立遺伝子が対立遺伝子プロファイルを提供します。一連のプロファイルは、株の分類の識別マーカーになります。1 つのヌクレオチドでも異なる配列は異なる対立遺伝子として割り当てられ、対立遺伝子間のヌクレオチドの差異の数を考慮して重み付けは行われません。これは、複数のヌクレオチド サイトにおける差異が複数の点突然変異の結果なのか、単一の組み換え交換の結果なのかを区別できないためです。各遺伝子座の潜在的な対立遺伝子の数が多いため、数十億の異なる対立遺伝子プロファイルを区別することができ、各遺伝子座で最も一般的な対立遺伝子を持つ株は、偶然に 10,000 分離株に 1 回程度しか発生しないと予想されます。^{[要出典] MLST は高い識別力を提供するにもかかわらず、ハウスキーピング遺伝子におけるヌクレオチド変化の蓄積は比較的ゆっくりとしたプロセスであり、細菌}分離株の対立遺伝子プロファイルは 時間の経過とともに十分に安定しているため、この方法は世界的な疫学研究に最適です。

分離株の関連性は、対立遺伝子プロファイル間のペアワイズ差異マトリックス、eBURST、または最小スパニングツリー(MST) を使用して構築された樹形図として表示されます。樹形図は、共通の祖先から派生したと想定できる同一または非常に類似した対立遺伝子プロファイルを持つ分離株を表示する便利な方法にすぎません。7 つの遺伝子座のうち 3 つ以上が異なる分離株間の関係は信頼性が低い可能性があり、系統発生を推測するために使用すべきではありません。^{[3] [4]} MST は、ツリーのすべての枝の距離の合計が最小になるようにすべてのサンプルを接続します。^[5]

あるいは、分離株の関連性は、多座位配列解析（MLSA）。これは割り当てられた対立遺伝子を使用せず、代わりにハウスキーピング遺伝子の遺伝子断片の配列を連結し、この連結された配列を使用して系統関係を決定します。MLSTとは対照的に、この解析では、1つのヌクレオチドのみが異なる配列間に高い類似性を割り当て、複数のヌクレオチドが異なる配列間に低い類似性を割り当てます。結果として、この解析はクローン進化する生物に適しており、組換えイベントが非常に頻繁に発生する生物にはあまり適していません。また、近縁種間の系統関係を決定するためにも使用できます。^[6] MLSTとMLSAという用語は非常に頻繁に交換可能であると考えられています。ただし、各解析方法には独特の機能と用途があるため、これは正しくありません。正しい用語を使用するように注意する必要があります。

以前にも血清学的タイピング手法が細菌分離株の区別に確立されていましたが、免疫学的タイピングには、少数の抗原遺伝子座への依存や、異なる抗原変異体に対する抗体の反応性が予測できないなどの欠点があります。病原体の関連性を決定するために、パルスフィールドゲル電気泳動 ( PFGE )、リボタイピング、PCR ベースのフィンガープリンティングなど、いくつかの分子タイピングスキームが提案されています。しかし、これらの DNA バンドベースのサブタイピング法では、意味のある進化分析は提供されません。PFGE は多くの研究者によって「ゴールドスタンダード」と見なされていますが、処理中に DNA が劣化するため (ゲル塗抹標本)、多くの株はこの技術ではタイピングできません。

MLST のアプローチは、複数のコア代謝酵素の異なる電気泳動移動度 (EM) に基づくマルチ遺伝子座酵素電気泳動 (MLEE) とは異なります。各遺伝子座の対立遺伝子は、その産物の EM を定義します。酵素間のアミノ酸配列が異なると、ゲル上で実行したときに移動度が異なり、バンドが異なります。分離株の関連性は、電気泳動タイプ間のペアワイズ差異のマトリックスから生成された樹状図で視覚化できます。この方法は、酵素表現型の多様性が DNA 配列の多様性の代理にすぎないという事実から生じるいくつかの理由により、MLST よりも解像度が低くなります。第 1 に、酵素は、異なるバンドを生成するのに十分な EM の違いがなくても、異なるアミノ酸配列を持つ場合があります。第 2 に、「サイレント突然変異」により、コードされたアミノ酸を変更せずに遺伝子の DNA 配列が変化する場合があります。第三に、酵素の表現型は環境条件に応じて簡単に変化し、MLEE 結果の再現性に悪影響を及ぼします。酵素の一般的な変化は、リン酸化、補因子の結合、輸送配列の切断です。これにより、異なる研究室で取得された MLEE データの比較可能性も制限されますが、MLST は移植可能で比較可能な DNA 配列データを提供し、自動化と標準化に大きな可能性を秘めています。

MLST をDNA バーコーディングと混同しないでください。後者は、短い遺伝子マーカーを使用して特定の真核生物種を認識する分類法です。これは、ミトコンドリア DNA (mtDNA) またはリボソーム DNAシストロンの一部が比較的速い変異率を持ち、種間で配列に大きなばらつきが生じるという事実に基づいています。mtDNA 法は真核生物でのみ可能です (原核生物にはミトコンドリアがないため)。一方、MLST は、当初は原核生物向けに開発されましたが、現在では真核生物にも応用されており、原理的にはどの界にも適用できます。

MLST は非常に明確で、移植性に優れています。ST 判定に必要な材料は、研究室間で交換できます。プライマー シーケンスとプロトコルには電子的にアクセスできます。再現性と拡張性を備えています。MLST は自動化されており、ハイ スループット シーケンシングとバイオインフォマティクスの進歩と、確立された集団遺伝学技術を組み合わせています。MLST データを使用して、細菌間の進化的関係を調査できます。MLST は、分離株を区別するための優れた識別力を備えています。

MLST の応用範囲は広く、科学、公衆衛生、獣医学のコミュニティや食品業界にリソースを提供します。以下は MLST の応用例です。

カンピロバクターは、細菌感染性腸疾患の一般的な原因物質であり、通常は加熱不十分な家禽や低温殺菌されていない牛乳から発生します。しかし、その疫学は十分に理解されていません。発生がめったに検出されないため、発生源や感染経路の追跡が容易ではないためです。さらに、カンピロバクターのゲノムは遺伝的に多様で不安定であり、ゲノム間およびゲノム内の組み換えが頻繁に発生し、相変異も伴うため、多くのタイピング方法によるデータの解釈が複雑になります。最近まで、MLST 技術の適用により、カンピロバクターのタイピングは大きな成功を収め、MLST データベースに追加されました。2008 年 5 月 1 日現在、カンピロバクターMLST データベースには 3516 の分離株と、カンピロバクターに関する研究で MLST を使用または言及している約 30 件の出版物が含まれています(http://pubmlst.org/campylobacter/)。

MLST は、ヒト集団内およびヒト、植物、動物に病原性がある可能性のある株の変異体における細菌のより豊かな質感の画像を提供してきました。 MLST 技術は、 6 つの遺伝子座を使用してNeisseria meningitidis を特徴付けるために、Maiden ら (1) によって初めて使用されました。 MLST の適用により、世界中で侵襲性疾患の原因であることが知られている主要な髄膜炎菌系統が明確に解明されました。 主要な侵襲性系統間の識別力を向上させるために、現在は 7 つの遺伝子座が使用されており、髄膜炎菌分離株を特徴付けるための最適な方法として多くの研究室に受け入れられています。N. meningitidisでは組換え交換が一般的に発生し、髄膜炎菌クローンの急速な多様化につながることはよく知られた事実です^[7]。 MLST は、クローン多様化率が一般的に低い他の細菌種内のクローンを特徴付けるための信頼性の高い方法を提供することに成功しました。

黄色ブドウ球菌は多くの病気を引き起こします。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌( MRSA ) は、バンコマイシンを除くほぼすべての抗生物質に対する耐性により、懸念が高まっています。しかし、地域社会におけるほとんどの重篤な黄色ブドウ球菌感染症、および病院における多くの重篤な黄色ブドウ球菌感染症は、メチシリン感受性分離株 (MSSA) によって引き起こされており、重篤な病気に関連する毒性の強い MSSA クローンを特定する試みはほとんど行われていません。そのため、MRSA クローンを特徴付ける明確な方法を提供し、重篤な病気に関連する MSSA クローンを特定するために、MLST が開発されました。

S. pyogenesは、咽頭炎から壊死性筋膜炎を含む生命を脅かす伝染性膿痂疹まで、さまざまな疾患を引き起こします。S . pyogenesのMLSTスキームが開発されました。現在、データベース（mlst.net） ^[8]には、この生物の世界的な多様性を代表する分離株の対立遺伝子プロファイルと、重篤な侵襲性疾患からの分離株が含まれています。 ^[9]

C. albicans はヒトの真菌病原体であり、院内感染性血流感染症の原因となります。MLST 技術はC. albicans分離株の特徴付けに使用されています。異なる遺伝子座の対立遺伝子の組み合わせにより、株の識別に使用できる固有の二倍体配列タイプが生成されます。MLST は、病院におけるC. albicansの疫学、およびヒトや動物の宿主を含む多様な生態学的ニッチから得られたC. albicans分離株の多様性の研究に効果的に適用できることが実証されています。

クロノバクター属は7種から構成されています。2007年以前は、これらの生物にはEnterobacter sakazakiiという単一の種名が適用されていました。クロノバクターMLSTは、16S rDNA配列が必ずしも正確ではなく、バイオタイピングが主観的すぎるため、当初はC. sakazakiiとC. malonaticusを区別するために適用されました。 ^[10]クロノバクターMLSTスキームは、7つの対立遺伝子、atpD、fusA、glnS、gltB、gyrB、infB、ppsAを使用し、系統解析（MLSA）と比較ゲノミクス用の3036 bpの連結配列を提供します。^{[11] MLSTは、新しい}クロノバクター種 の正式な認識にも使用されています。^{[12]この方法により}、 1つの遺伝子系統、シーケンスタイプ4（ST4）と新生児髄膜炎の症例との間に強い関連性があることが明らかになりました。^[13] Cronobacter MLSTサイトはhttp://www.pubMLST.org/cronobacterです。

MLSTは集団遺伝学研究に最適と思われますが、費用がかかります。ハウスキーピング遺伝子の配列保存のため、MLSTは細菌株を区別する識別力が不足することがあり、疫学調査での使用が制限されます。MLSTの識別力を改善するために、リステリア・モノサイトゲネスを用いた多毒性遺伝子座配列タイピング（MVLST）アプローチが開発されました。^[14] MVLSTはMLSTの利点を広げますが、ハウスキーピング遺伝子よりも多型性がある可能性のある毒性遺伝子をターゲットにします。集団遺伝学は、流行における唯一の関連要因ではありません。毒性因子も疾患を引き起こす上で重要であり、集団遺伝学研究ではこれらを監視するのに苦労しています。これは、関与する遺伝子が集団遺伝学の枠組みと比較して、株間で高度に組み換えられ、移動性が高いことが多いためです。したがって、たとえば大腸菌では、毒素遺伝子を持つ株を特定することが、流行している株の集団遺伝学に基づく評価よりも重要です。

第二世代のシーケンシング技術の出現により、比較的低コストで労力をかけずに細菌ゲノム全体の配列情報を取得できるようになり、MLST が最初に開発されたときのやり方のように各遺伝子座を個別にシーケンシングするのではなく、全ゲノム配列情報から MLST を割り当てることができるようになりました。^[15] 全ゲノムシーケンシングにより、細菌株を区別するためのより豊富な情報が得られます (MLST では、細菌ゲノムの残りの部分を無視して、ゲノム配列の約 0.1% を使用してタイプを割り当てます)。たとえば、多数の分離株の全ゲノムシーケンシングにより、クレブシエラ・ニューモニエの単一の MLST 系統 ST258 が2 つの異なる遺伝子系統群で構成されていることが明らかになりました。^{[16] これにより}、これらの多剤耐性菌の進化と拡散に関する追加情報が得られ、ST258 の単一クローン起源という以前の仮説が反証されました。^[17]

MLST データベースには、各生物の参照アレル配列と配列タイプが含まれており、疫学データも分離されています。Web サイトには、ユーザーがアレル配列と配列タイプを照会できる照会および分析ソフトウェアが含まれています。MLST は、研究者や公衆衛生従事者のツールとして広く使用されています。

MLST データベースの大部分は、現在オックスフォード大学にある Web サーバー (pubmlst.org) でホストされています。

このサイトでホストされているデータベースには、生物固有の参照対立遺伝子配列と個々の生物の ST のリストが保存されています。

使用されたシーケンスの収集とフォーマットを支援するために、Firefox 用のシンプルで無料のプラグインが開発されました (リンクはWayback Machineで 2014-02-22 にアーカイブされています)。

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• PubMLST - オックスフォード大学
• コーク大学でホストされているデータベース
• パスツール研究所が保有するデータベース
• BioNumerics すべての生物学的データを保存および分析するための 1 つのユニバーサル バイオインフォマティクス ソリューション。MLST ワークフロー全体を実行し、結果を他のタイピング方法やメタデータと比較できます。対立遺伝子配列と ID は、全ゲノム配列から導出することもできます。
• CLC 微生物ゲノミクス モジュールには、発生、宿主、地理的位置などのメタ情報のコンテキストで MLST 用のツール セットとすぐに使用できるワークフローが含まれており、他のタイピング方法を使用して得られたタイピング結果と簡単に比較できます。