メチル化DNA免疫沈降

メチル化 DNA 免疫沈降法(MeDIP または mDIP) は、分子生物学における大規模 (染色体全体またはゲノム全体) な精製技術であり、メチル化 DNA 配列を濃縮するために使用されます。この技術は、5-メチルシトシン(5mC)に対して産生された抗体を介してメチル化 DNA 断片を分離することから構成されます。この技術は、2005 年にWeber M.ら^[1]によって初めて説明され、メチル化 DNA の精製画分を高解像度 DNAマイクロアレイ( MeDIP-chip ) や次世代シーケンシング(MeDIP-seq) などのハイスループット DNA 検出方法に入力できるため、実行可能なメチロームレベルの評価への道を開くのに役立ちました。とはいえ、メチロームの理解はまだ初歩的であり、他のエピジェネティック特性と同様に、パターンが細胞タイプごとに異なる という事実によって研究は複雑になっています。

DNA メチル化は、メチルトランスフェラーゼによるシトシン 5 位の可逆的なメチル化を指し、多細胞生物における主要なエピジェネティック修飾である。 ^[2] 哺乳類では、この修飾は主にCpG 部位で発生し、 CpG アイランドと呼ばれる領域に集まる傾向がある。^[3] CpG アイランドの一部は、転写開始部位のプロモーター領域と重なったり近接したりすることができる。修飾は他の部位でも発生する可能性があるが、^{[4]これらのいずれかの部位でのメチル化は、}転写因子の結合を妨害するか、クロマチン構造を抑制状態に変化させることによって、遺伝子発現を抑制する可能性がある。 ^[5]

病態研究は、DNAメチル化の役割を理解するための取り組みを大いに促進してきました。現在、主な研究対象は、がんなどの病態を調査して、広範囲にわたるメチル化変化を起こしたDNA領域を特定することです。これらの領域に含まれる遺伝子は、疾患の根底にある遺伝的原因に対するメカニズムの説明を提供できる可能性があるため、機能的に興味深いものです。たとえば、がん細胞の異常なメチル化パターン^{[6] [7] [8]は、当初、}腫瘍抑制遺伝子のような遺伝子がサイレンシングされるメカニズムであることが示されましたが^[9]、後にはるかに広範囲の遺伝子タイプが影響を受けることが観察されました。^{[10] [11] [12]}

メチル化解析には、タイピング技術とプロファイリング技術の2つのアプローチがあります。タイピング技術は、多数のサンプルにわたる少数の遺伝子座を対象としており、PCR、制限酵素、質量分析などの技術を使用します。MeDIPなどのプロファイリング技術は、ゲノムまたはメチローム全体のメチル化の評価を対象としています。これには、制限ランドマークゲノムスキャン（RLGS）^[13]や、 DNAを亜硫酸水素塩で処理してメチル化されていないシトシン残基をウラシルに変換する亜硫酸水素塩変換ベースの方法が含まれます。^{[14] [15] [16] [17]}

メチロームをマッピングおよびプロファイリングする他の方法は効果的ですが、解像度、スループットのレベル、または実験の変動に影響を与える可能性のある制限がないわけではありません。たとえば、RLGS は、制限酵素のターゲットとなるゲノム内の制限部位の数によって制限されます。通常、最大で約 4100 のランドマークを評価できます。^[18] 亜硫酸水素塩シーケンシングベースの方法は、単一ヌクレオチドの解像度が可能ですが、欠点があります。メチル化されていないシトシンからウラシルへの変換が不安定になる可能性があるということです。^[19] さらに、亜硫酸水素塩変換をDNA マイクロアレイと組み合わせて亜硫酸水素塩変換された部位を検出すると、DNA の配列の複雑さが低下するという問題があります。ゲノム全体を包括的にプロファイリングできるマイクロアレイは、利用できる固有のプローブが少なくなるため、設計が難しくなります。^[20]

以下のセクションでは、高解像度アレイハイブリダイゼーションまたはハイスループットシーケンシングと組み合わせた MeDIP の方法について概説します。各 DNA 検出方法については、実験後の処理と分析についても簡単に説明します。メチル化配列を識別するために使用されるテクノロジーに応じて、生データの異なる後処理が必要です。これは、ChIP-chipおよびChIP-seq を使用して生成されたデータに類似しています。

ゲノムDNAは細胞から抽出（DNA抽出）され、精製される。精製されたDNAはその後超音波処理されてランダムな断片に切断される。この超音波処理プロセスは迅速で簡単で、制限酵素による偏りを回避できる。結果として得られる断片の長さは300～1000塩基対（bp）だが、通常は400～600 bpである。^[21] これらの断片の長さが短いことは、十分な解像度を得ること、免疫沈降の下流工程の効率を改善すること、断片長の影響や偏りを減らすことに重要である。また、断片のサイズは5-メチルシチジン（5mC）抗体の結合に影響する。これは、抗体が効率的に結合するためには1つの5mCだけでは不十分だからである。^{[22]抗体の結合親和性を}さらに 向上させるために、DNA断片は変性されて一本鎖DNAとなる。次に、古典的な免疫沈降法が適用されます。抗マウスIgGに結合した磁気ビーズを使用して抗 5mC 抗体を結合し、結合していない DNA を上清から除去します。DNA を精製するには、プロテイナーゼ Kを加えて抗体を消化し、DNA を放出します。これを収集して DNA 検出用に準備します。

実験手順の詳細については^{[1] [19] [23] [24]を参照。}

上記の超音波処理ステップ後に得られた入力 DNA の一部は、シアニン-5 (Cy5、赤) デオキシシトシン三リン酸で標識され、免疫沈降ステップ後に濃縮されたメチル化 DNA はシアニン-3 (Cy3、緑) で標識されます。標識された DNA サンプルは、2 チャネルの高密度ゲノムマイクロアレイ上で共ハイブリダイズされ、存在と相対量を調べます。この比較の目的は、ハイブリダイゼーション レベルに有意な差がある配列を識別し、それによって目的の配列が濃縮されていることを確認することです。MeDIP 配列のアレイベースの識別は、アレイ設計に制限されます。その結果、解像度はアレイ設計内のプローブに制限されます。ほとんどのアレイ技術の場合と同様に、信号処理では、ノイズなどのハイブリダイゼーションの問題を補正するための追加の標準ステップが必要です。

詳細については ^{[23] [24] [25]}を参照してください。

MeDIP-seqアプローチ、すなわちMeDIPと454パイロシーケンシングやIllumina（Solexa）などの次世代のショートリードシーケンシング技術を組み合わせたアプローチは、 2008年にDownらによって初めて説明されました。^[20] メチル化されたDNA断片のハイスループットシーケンシングにより、多数のショートリード（技術に応じて36〜50bp ^[26]または400bp ^[27]）が生成されます。ショートリードは、Mapping and Assembly with Quality（Maq）などのアライメントソフトウェアを使用して参照ゲノムにアライメントされます。Maqはベイズアプローチと塩基およびマッピング品質を使用して、アライメントのエラー確率をモデル化します。^[28] 次に、リードを拡張して、超音波処理ステップからの約400〜700bpの断片を表すことができます。これらの拡張リードのカバレッジを使用して、領域のメチル化レベルを推定できます。 Ensembl などのゲノムブラウザを使用してデータを視覚化することもできます。

データの品質と精度を評価するためのアプローチの検証は、定量PCRで行うことができます。これは、MeDIPサンプルの配列をメチル化されていないコントロール配列と比較することによって行われます。次に、サンプルをゲル上で走査し、バンドの強度を比較します。^[19] 相対的な強度は、エンリッチメントを見つけるためのガイドとして役立ちます。結果をMeDIPチップの結果と比較して、必要なカバレッジを決定することもできます。

MeDIPで生成されたデータを観察する場合、ゲノム全体のメチル化されたCpGサイトの密度が異なると、DNAメチル化レベルの推定が混乱する可能性があります。これは、CpGが少ない（密度が低い）領域の解析で問題になる可能性があります。この密度の問題の理由の1つは、免疫沈降の効率への影響です。Downら[20]は、メチル^化されたCpGサイトの密度をモデル化することにより、MeDIPで生成されたデータから絶対メチル化レベルを推定するツールを開発しました。このツールは、メチル化解析のためのベイジアンツール（Batman）と呼ばれています。この研究では、メチル化レベルを推定できるプロモーター、遺伝子コード領域、アイランド、および調節要素のすべてのCpGサイトの約90％をカバーしていると報告されています。これは、以前の方法よりもほぼ20倍優れたカバレッジです。

MeDIP-seq または MeDIP-chip を使用した研究は、どちらもゲノム全体のアプローチであり、メチロームの機能マッピングを取得するという共通の目的を持っています。 DNA メチル化領域が特定されると、いくつかのバイオインフォマティクス分析を適用して、特定の生物学的疑問に答えることができます。 1 つの明らかなステップは、これらの領域に含まれる遺伝子を調査し、それらの抑制の機能的重要性を調査することです。 たとえば、がんにおける腫瘍抑制遺伝子のサイレンシングは、DNA メチル化に起因する可能性があります。^[29] 既知の腫瘍抑制遺伝子の過剰メチル化とそれに続く抑制につながる変異イベントを特定することにより、病気の原因に寄与する要因をより具体的に特徴付けることができます。 あるいは、正常にメチル化されていることがわかっているが、何らかの変異イベントの結果としてサイレンシングされなくなった遺伝子を特定することもできます。

また、DNAメチルトランスフェラーゼ（DNMT）などのエピジェネティック制御因子が影響を受けているかどうかを調査して特定することもできます。^[21]これらの場合には、濃縮はより制限される可能性があります。

遺伝子セット解析（例えばDAVIDやGoSeqなどのツールを使用）は、ハイスループットメチル化データ（MeDIP-seqやMeDIP-ChIPなど）に適用すると、大きな偏りが生じることが示されています。これは、サンプルラベルの順列を使用するか、各遺伝子を標的とするCpGプローブ/CpGサイトの数の差を制御する統計モデルを使用することで修正できることが示唆されています。^[30]

MeDIP を使用する際に注意すべき制限は、一般的な実験要因です。これには、手順で使用される 5mC 抗体の品質と交差反応性が含まれます。さらに、DNA 検出方法 (アレイ ハイブリダイゼーションやハイスループット シーケンシングなど) には、一般的に確立された制限があります。特にアレイベースの手順の場合、前述のように、分析される配列は、使用される特定のアレイ設計に制限されます。

ハイスループットの次世代シーケンシングに最も典型的な制限が適用されます。ゲノム内の反復領域へのアラインメント精度の問題により、それらの領域でのメチル化の解析精度が低下します。また、前述のように、短いリード（たとえば、イルミナゲノムアナライザーからの36〜50bp）は、ゲノムにアラインメントされたときにせん断されたフラグメントの一部を表します。したがって、正確なメチル化部位は、フラグメントサイズの関数であるウィンドウ内のどこにでも存在する可能性があります。^[19] この点で、亜硫酸水素塩シーケンシングははるかに高い解像度（単一のCpGサイトまで、単一のヌクレオチドレベル）を備えています。ただし、1000bp未満のCpGサイトのメチル化状態は有意に相関していることが示されているため、ほとんどのアプリケーションではこのレベルの解像度は必要ない可能性があります。^[20]

• Weberら2005 ^[1]は、マイクロアレイと組み合わせたMeDIPを使用して、女性の不活性X染色体が染色体全体にわたって高メチル化されていることを明らかにした。
• Keshet et al. 2006 ^[31]は、MeDIPチップを用いて大腸癌細胞と前立腺癌細胞の研究を行った。その結果、高メチル化領域にある遺伝子のゲノムワイド解析が行われ、癌細胞にはde novoメチル化の有益なメカニズムがあると結論づけられた。
• Zhang et al. 2006 ^[24]は、MeDIPチップを用いてシロイヌナズナの高解像度メチロームマッピングを得た。
• Novak et al. 2006 ^[32]は、MeDIPチップアプローチを用いてヒト乳がんにおけるメチル化関連サイレンシングを調査し、HOXA遺伝子クラスターの不活性化を観察した。

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