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| プロテイナーゼK | |||||||||
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 プロテイナーゼKの構造[1] | |||||||||
| 識別子 | |||||||||
| EC番号 | 3.4.21.64 | ||||||||
| CAS番号 | 39450-01-6 | ||||||||
| データベース | |||||||||
| インテンズ | IntEnzビュー | ||||||||
| ブレンダ | BRENDAエントリー | ||||||||
| エクスパス | NiceZyme ビュー | ||||||||
| ケッグ | KEGGエントリー | ||||||||
| メタサイク | 代謝経路 | ||||||||
| プリアモス | プロフィール | ||||||||
| PDB構造 | RCSB PDB PDBe PDBsum | ||||||||
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| プロテイナーゼK | |||||||
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| 識別子 | |||||||
| 生物 | |||||||
| シンボル | プロック | ||||||
| ユニプロット | P06873 | ||||||
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分子生物学では、プロテイナーゼK（EC 3.4.21.64、プロテアーゼK、エンドペプチダーゼK、トリチラキウムアルカリプロテイナーゼ、トリチラキウムアルバムセリンプロテイナーゼ、トリチラキウムアルバムプロテイナーゼK）は、広域スペクトルのセリンプロテアーゼです。[2] [3] [4]この酵素は、1974年に菌類パ レンギョドンティウムアルバム（以前はエンギョドンティウムアルバムまたはトリチラキウムアルバム）の抽出物で発見されました。[5]プロテイナーゼKは毛髪（ケラチン）を消化できるため、「プロテイナーゼK」という名前が付けられています。切断の主な部位は、αアミノ基がブロックされた脂肪族および芳香族アミノ酸のカルボキシル基に隣接するペプチド結合です。幅広い特異性のためによく使用されます。この酵素はペプチダーゼファミリーS8（ズブチリシン）に属します。プロテイナーゼ K の分子量は 28,900 ダルトン (28.9 kDa) です。
酵素活性
カルシウムによって活性化されたこの酵素は、疎水性アミノ酸（脂肪族、芳香族、その他の疎水性アミノ酸）の次にタンパク質を優先的に分解します。カルシウムイオンは酵素の活性には影響しませんが、酵素の安定性に寄与します。インキュベーション時間が長く、プロテアーゼ濃度が十分に高ければ、タンパク質は完全に分解されます。カルシウムイオンを除去すると酵素の安定性は低下しますが、タンパク質分解活性は残ります。 [6]プロテイナーゼKにはCa 2+の結合部位が2つあり、活性中心の近くにありますが、触媒機構には直接関与していません。残留活性は、通常核酸調製物を汚染するタンパク質を分解するのに十分です。したがって、核酸の精製のためのプロテイナーゼKによる消化は、通常EDTA（ヌクレアーゼなどの金属イオン依存性酵素の阻害）の存在下で行われます。
プロテイナーゼKは広いpH範囲（4～12）で安定しており、最適pHは8.0です。[5] 反応温度を37℃から50～60℃に上げると、0.5～1%のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）またはグアニジニウム塩化物（ 3M）、グアニジニウムチオシアネート（1M）、尿素（4M）の添加と同様に、活性が数倍に増加することがあります[議論あり（温度の出典なし）–議論]。上記の条件は、基質切断部位にアクセスしやすくすることで、プロテイナーゼKの活性を高めます。65℃を超える温度、トリクロロ酢酸（TCA）、またはセリンプロテアーゼ阻害剤AEBSF、PMSF、またはDFPは活性を阻害します。プロテイナーゼ K は、塩化グアニジニウム、チオシアン酸グアニジニウム、尿素、サルコシル、トリトン X-100、Tween 20、SDS、クエン酸、ヨード酢酸、EDTA、または Nα-トシル-Lys クロロメチルケトン (TLCK) や Nα-トシル-Phe クロロメチルケトン (TPCK) などの他のセリンプロテアーゼ阻害剤によって阻害されません[要出典]。
一般的に使用される緩衝液中のプロテアーゼK活性[7]
アプリケーション
プロテイナーゼ K は、分子生物学でタンパク質を消化し、核酸調製物から汚染物質を除去するためによく使用されます。核酸調製物にプロテイナーゼ K を添加すると、精製中に DNA または RNA を分解する可能性のあるヌクレアーゼが急速に不活性化されます。この酵素は、SDSや尿素などのタンパク質を変性させる化学物質、EDTAなどのキレート剤、スルフヒドリル試薬、トリプシンまたはキモトリプシン阻害剤の存在下で活性であるため、この用途に非常に適しています。プロテイナーゼ K は、DNaseおよびRNase を非常に効果的に不活性化するため、細胞溶解物 (組織、細胞培養細胞) 中のタンパク質の破壊や核酸の放出に使用されます。アプリケーションの例: プロテイナーゼ K は、特に 0.5～1% SDS が存在する場合、ほとんどの微生物または哺乳類の DNase および RNase が酵素によって急速に不活性化されるため、高度にネイティブで損傷のない DNA または RNA の分離に非常に役立ちます。
天然タンパク質に対する酵素の活性は、SDSなどの変性剤によって刺激されます。対照的に、ペプチド基質を使用して測定した場合、変性剤は酵素を阻害します。この結果の理由は、変性剤がタンパク質基質を展開し、プロテアーゼがアクセスしやすくなるためです。[8]
阻害剤
プロテイナーゼKには2つのジスルフィド結合があるが[9] 、還元剤（例：5 mM DTT）の存在下ではより高いタンパク質分解活性を示し、[10]、自身のジスルフィド結合の推定還元が不可逆的な不活性化につながらないことを示唆している。プロテイナーゼKは、フェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）、ジイソプロピルフルオロホスフェート（DFP）、または4-（2-アミノエチル）ベンゼンスルホニルフルオリド（AEBSF）などのセリンプロテアーゼ阻害剤によって阻害される。プロテイナーゼKの活性は、スルフィドリル修飾試薬であるパラクロロメルクリ安息香酸（PCMB）、N-α-トシル-L-リシル-クロロメチルケトン（TLCK）、またはN-α-トシル-L-フェニルアラニンクロロメチルケトン（TPCK）の影響を受けません[10]。ただし、これらの試薬が、通常は利用できないプロテイナーゼKチオールを露出させるジスルフィド還元試薬と一緒に含まれていた場合、阻害される可能性があります。
参考文献
- ^ Betzel C, Singh TP, Visanji M, Peters K, Fittkau S, Saenger W, Wilson KS (1993 年 7 月). 「プロテイナーゼ K と基質類似体ヘキサペプチド阻害剤の複合体の構造 (2.2 Å 分解能)」. J. Biol. Chem . 268 (21): 15854–8. doi : 10.1016/S0021-9258(18)82332-8 . PMID 8340410.
- ^ Morihara K, Tsuzuki H (1975). 「Tritirachium album Limber由来プロテアーゼKの合成ペプチドに対する特異性」. Agric. Biol. Chem . 39 (7): 1489–1492. doi : 10.1271/bbb1961.39.1489 .
- ^ Kraus E、Kiltz HH、Femfert UF (1976 年 2 月)。「酸化インスリン B 鎖に対するプロテアーゼ K の特異性」Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem . 357 (2): 233–7. PMID 943367。
- ^ Jany KD、Lederer G、Mayer B (1986)。「カビTritirachium album Limber由来のプロテアーゼKのアミノ酸配列」。FEBS Lett . 199 (2): 139–144. doi : 10.1016/0014-5793(86)80467-7 . S2CID 85577597。
- ^ ab Ebeling W、Hennrich N、Klockow M、Metz H、Orth HD、Lang H (1974 年 8 月)。 「トリチラキウムのアルバム Limber からのプロテイナーゼ K」。ユーロ。 Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．47 (1): 91-7。土井：10.1111/j.1432-1033.1974.tb03671.x。PMID 4373242。
- ^ Müller A, Hinrichs W, Wolf WM, Saenger W (1994 年 9 月). 「1.5 Å 解像度でのカルシウムフリープロテアーゼ K の結晶構造」. J. Biol. Chem . 269 (37): 23108–11. doi :10.2210/pdb2pkc/pdb. PMID 8083213.
- ^ Ag-Scientific. 「プロテイナーゼKに関するよくある質問」。2020年10月17日時点のオリジナルよりアーカイブ。2020年10月15日閲覧。
- ^ Hilz H, Wiegers U, Adamietz P (1975). 「変性剤によるプロテイナーゼKの作用の刺激：核酸の単離と「マスクされた」タンパク質の分解への応用」.ヨーロッパ生化学ジャーナル. 56 (1): 103–108. doi : 10.1111/j.1432-1033.1975.tb02211.x . PMID 1236799.
- ^ “PROK - プロテイナーゼK前駆体 - Parengyodontium album”. Uniprot . 2019年12月11日. 2020年11月19日時点のオリジナルよりアーカイブ。2020年2月7日閲覧。
- ^ ab "Novagen Proteinase K protocol" (PDF) . Sigma Aldrich . 2019年12月11日. 2024年6月6日時点のオリジナルよりアーカイブ(PDF) . 2020年2月7日閲覧。
外部リンク
- プロテイナーゼK ワージントン酵素マニュアル
