同位体標識

同位体標識（または同位体標識）は、化学反応、代謝経路、または生物細胞を通過する同位体（中性子数に検出可能な変動がある原子）を追跡するために使用される技術です。^[1]反応物は、 1つまたは複数の特定の原子をその同位体に置き換えることによって「標識」されます。次に、反応物は反応を受けます。生成物中の同位体の位置を測定し、同位体原子が反応または細胞の代謝経路でどのような順序に従ったかを判断します。同位体標識に使用される核種は、安定核種または放射性核種です。後者の場合、標識は放射性標識と呼ばれます。

同位体標識では、標識同位体の存在を検出する方法が複数あります。質量、振動モード、または放射性崩壊です。質量分析は同位体の質量の差を検出し、赤外線分光法は同位体の振動モードの差を検出します。核磁気共鳴は、異なる磁気回転比を持つ原子を検出します。放射性崩壊は、電離箱またはゲルの オートラジオグラフによって検出できます。

同位体標識の使用例としては、水中のフェノール(C ₆ H _{5 OH) を通常の}水素(プロチウム) を重水素に置き換える(重水素標識) 研究がある。フェノールを重水素化水(通常のH ₂ Oに加えて D ₂ O を含む水) に加えると、フェノールのヒドロキシル基の水素が重水素に置き換わることが観察され(C ₆ H ₅ OD となる)、フェノールが水と容易に水素交換反応を起こすことがわかる。影響を受けるのはヒドロキシル基のみであり、他の 5 つの水素原子は交換反応に関与しないことがわかる。^{[引用が必要]}

同位体トレーサー（「同位体マーカー」または「同位体ラベル」とも呼ばれる）は、化学反応や相互作用を理解するために化学および生化学で使用されます。この技術では、対象分子の1 つ以上の原子を、同じ化学元素だが同位体が異なる原子（放射性トレーシングで使用される放射性同位体など）と置換します。ラベル付けされた原子は陽子の数が同じであるため、ラベル付けされていない原子とほぼ同じように動作し、いくつかの例外を除いて、調査中の反応を妨害しません。ただし、中性子の数が異なるため、同じ元素の他の原子とは別に検出できます。

核磁気共鳴(NMR) と質量分析(MS) は、化学反応のメカニズムを調査するために使用されます。NMR と MS は同位体の違いを検出し、生成物の構造における標識原子の位置に関する情報を決定できます。生成物の同位体原子の位置に関する情報を使用して、最初の代謝物が生成物に変換するために使用する反応経路を決定できます。放射性同位体は、ゲル電気泳動のゲルのオートラジオグラフを使用してテストできます。放射性同位体を含む化合物から放出される放射線は、写真フィルムを暗くし、ゲル内の標識化合物の相対的な位置を記録します。

同位体トレーサーは、同位体比の形でよく使用されます。同じ元素の 2 つの同位体の比率を調べることで、同位体存在量のより小さな変動を圧倒してしまう、元素の全体的な存在量に関する影響を回避できます。同位体トレーサーは、地球システムにおける複雑な混合プロセスを理解するために使用できるため、地質学で最も重要なツールの 1 つです。地質学における同位体トレーサーの応用に関する詳細な説明は、同位体地球化学の見出しの下で取り上げられています。

同位体トレーサーは通常、安定同位体トレーサーと放射性同位体トレーサーの2つのカテゴリに分類されます。安定同位体トレーサーは非放射性同位体のみを対象とし、通常は質量に依存します。理論的には、2つの安定同位体を持つすべての元素を同位体トレーサーとして使用できます。ただし、最も一般的に使用される安定同位体トレーサーは、自然系で容易に分別される比較的軽い同位体を対象としています。同位体シグネチャーも参照してください。放射性同位体トレーサー^[3]は、放射性崩壊によって生成された同位体を対象とし、通常は非放射性同位体（地球上での存在量は放射性崩壊によって変化しない）と一定の比率で存在します。

安定同位体標識には、いくつかの化学および生化学システムをモデル化するために使用できるトレーサーとして機能する非放射性同位体の使用が含まれます。選択された同位体は、核磁気共鳴 （NMR）および質量分析（MS）で識別できる化合物のラベルとして機能することができます。最も一般的な安定同位体には、² H、¹³ C、および^{15 Nがあり、これらはさらに、} NMR溶媒、アミノ酸、核酸、脂質、一般的な代謝物、および細胞増殖培地に生成できます。^[5]安定同位体を使用して生成される化合物は、標識同位体の割合（つまり、均一に標識された^{13 Cグルコースの30％には、 13}炭素同位体で標識された 30％と自然に標識された炭素の70％の混合物が含まれています）または化合物上の特定の標識炭素位置（つまり、グルコースの最初の炭素位置で標識された 1- ¹³ Cグルコース）によって指定されます。

解糖経路とペントースリン酸経路から採用された反応ネットワークが示されており、この反応ネットワークでは、標識された炭素同位体が反応ネットワーク全体の異なる炭素位置に再配置されます。ネットワークは、炭素位置 1 と 2 に標識^{13 C が付いた 6 つの炭素原子を持つ}フルクトース 6-リン酸(F6P) から始まります。1,2- ¹³ C F6P は、2 つのグリセルアルデヒド 3-リン酸(G3P)、1 つの 2,3- ¹³ C T3P、および 1 つの非標識 T3P になります。2,3- ^{13 C T3P は、}セドヘプツロース 7-リン酸(S7P)と反応して、非標識エリスロース 4-リン酸(E4P) と 5,6- ¹³ C F6Pを形成できます。非標識 T3P は S7P と反応して、非標識生成物を合成します。^[4]この図は、位置特異的に標識された化合物を用いた反応を通じて炭素原子の再配置を発見するための安定同位体標識の使用を示しています。

安定同位体標識を用いた代謝フラックス分析(MFA)は、細胞内の代謝経路および反応を通じた特定の元素のフラックスを説明する重要なツールです。同位体標識を細胞に供給し、標識された供給を利用して細胞を増殖させます。定常代謝フラックス分析では、細胞は定常状態(細胞に出入りする同位体が時間とともに一定) または準定常状態 (一定期間定常状態に達する) に到達する必要があります。^[6]出力代謝物の同位体パターンが決定されます。出力同位体パターンは、各反応を通じたフラックスの大きさ、反応物から生成物への変換率を見つけるために使用できる貴重な情報を提供します。^[7]

この図は、異なるラベルを使用して特定の反応を通るフラックスを判定する能力を示しています。元の代謝物である 3 炭素化合物は、1 つの反応で 2 炭素代謝物と 1 炭素代謝物に分割してから再結合するか、3 炭素代謝物のままになる能力があると仮定します。反応に代謝物の 2 つの同位体が等量で提供され、1 つは完全にラベル付けされ (青い円)、一般に均一ラベル付けと呼ばれ、もう 1 つは完全にラベル付けされていません (白い円)。図の左側の経路では代謝物の変化は見られませんが、右側では分割と再結合が見られます。図に示すように、代謝物が左側の経路のみを通る場合、均一ラベル付け代謝物とラベル付けされていない代謝物の比率は 50:50 のままです。代謝物が右側のみを通る場合、新しいラベル付けパターンが発生する可能性がありますが、すべて等量です。元の代謝物が経路の左側をどのくらい通るか、または経路の右側をどのくらい通るかによって、他の割合が発生することがあります。ここでは代謝物の半分が左側に、半分が右側に分布する割合を示していますが、他の割合になることもあります。^[8] 1つの化合物中の標識原子と非標識原子のこれらのパターンは、同位体異性体を表します。異なる標識の代謝物の同位体分布を測定することで、各反応を通るフラックスを決定することができます。^[9]

MFA は、同位体標識から収集したデータと各反応の化学量論、制約、および最適化手順を組み合わせて、フラックス マップを解決します。可逆反応は、フラックスを見つけるために必要な熱力学的制約を提供します。反応の化学量論を含むマトリックスが構築されます。細胞内フラックスは、シミュレートされたフラックスを化学量論モデルに挿入する反復法を使用して推定されます。シミュレートされたフラックスは、各反応で反応物が生成物に変換される速度を示すフラックス マップに表示されます。^[7]ほとんどのフラックス マップでは、矢印が太いほど、反応のフラックス値が大きくなります。^[10]

同位体異性体間の差異を測定するあらゆる技術を使用できます。安定同位体標識における質量同位体異性体を測定するために、核磁気共鳴(NMR) と質量分析(MS) という 2 つの主要な方法が開発されました。

プロトンNMRは、¹³ C標識実験に使用された最初の技術でした。この方法を使用すると、特定の代謝物プール内の各プロトン化炭素位置を他の位置とは別に観察できます。^[11]これにより、その特定の位置で標識された同位体の割合を知ることができます。プロトンNMRの制限は、代謝物にn個の炭素原子がある場合、最大でn個の異なる位置濃縮値しか存在できないことです。これは、総同位体情報のほんの一部にすぎません。プロトンNMR標識の使用には制限がありますが、純粋なプロトンNMR実験は、より多くの同位体情報を含む実験よりもはるかに簡単に評価できます。

プロトンNMRに加えて、13C NMR技術を使用すると、^同位体異性体の分布をより詳細に観察することができます。ラベル付けされた炭素原子は、分子内の直接隣接する原子のラベル付け状態に応じて、異なる超微細分裂信号を生成します。^[11]隣接する炭素原子がラベル付けされていない場合は、シングレットピークが現れます。隣接する炭素原子の1つだけがラベル付けされている場合は、ダブレットピークが現れます。ダブレット分割のサイズは、隣接する炭素原子の官能基によって異なります。隣接する2つの炭素原子がラベル付けされている場合、ダブレットの分割が等しい場合、ダブレットのダブレットはトリプレットに退化する可能性があります。

代謝フラックス分析の目的で NMR 技術を使用することの欠点は、NMR がかなり特殊な分野であるため、他の NMR アプリケーションと異なることです。NMR 分光計は、すべての研究チームで直接利用できるとは限りません。NMR 測定パラメータの最適化とピーク構造の適切な分析には、熟練した NMR 専門家が必要です。特定の代謝物では、追加の同位体データを取得するために特殊な測定手順が必要になる場合もあります。さらに、ピーク領域の正確な量を決定するため、および絡み合った一重項、二重項、三重項ピークの分解を識別するために、特別に適合したソフトウェア ツールが必要です。

核磁気共鳴とは対照的に、質量分析法（MS）は代謝フラックス分析実験にもっと適用でき、感度の高い別の方法です。MS機器にはさまざまな種類があります。2次元核磁気共鳴（2D-NMR）とは異なり、MS機器は加水分解物に直接作用します。^[11]

ガスクロマトグラフィー質量分析法 ( GC-MS ) では、MS をガスクロマトグラフに接続して加水分解物の化合物を分離します。GC カラムから溶出した化合物はイオン化され、同時に断片化されます。GC-MS を使用する利点は、分子イオンの質量同位体だけでなく、複数の断片の質量同位体スペクトルも測定され、測定情報が大幅に増加することです。

液体クロマトグラフィー質量分析法（LC-MS）では、GCが液体クロマトグラフに置き換えられます。^[12]主な違いは、化学誘導体化が不要であることです。ただし、LC-MSのMFAへの応用はまれです。

いずれの場合も、MS 機器は特定の同位体分布をその分子量で分割します。特定の代謝物の同位体のうち、同じ数の標識炭素原子を含むものはすべて、1 つのピーク信号に収集されます。すべての同位体マーは MS スペクトルの 1 つのピークに寄与するため、各ピークのパーセンテージ値を計算し、質量同位体分率を得ることができます。 [ ^11] n 個の炭素原子を持つ代謝物の場合、n+1 個の測定値が生成されます。正規化後、n 個の有益な質量同位体量が残ります。^[11]

MS 技術を使用する際の欠点は、ガスクロマトグラフィーの場合、電荷を持つ分子を得るためにサンプルを化学的誘導体化によって準備する必要があることです。サンプルの誘導体化に使用される化合物は多数あります。N,N-ジメチルホルムアミドジメチルアセタール (DMFDMA) ^[13]と N-(tert-ブチルジメチルシリル)-N-メチルトリフルオロアセトアミド (MTBSTFA) ^[14]は、アミノ酸の誘導体化に使用されてきた化合物の 2 つの例です。

さらに、強い同位体効果が観察され、GCカラム内の異なる標識の同位体異性体の保持時間に影響を及ぼします。GCカラムの過負荷も防止する必要があります。^[14]

最後に、炭素以外の原子の自然存在比も質量同位体スペクトルの乱れにつながります。たとえば、分子内の各酸素原子は、¹⁷ O同位体としても^{18 O同位体としても存在する可能性があります。同位体の自然存在比のより重要な影響は、同位体29} Siと³⁰ Siの自然存在比を持つシリコンの影響です。SiはMS技術の誘導体化剤として使用されます。^[11]

放射性同位体標識は、物質のサンプルがシステムを通過する過程を追跡する技術です。物質は、その化学組成に放射性核種を含めることで「標識」されます。これらの核種が崩壊すると、放射される放射線を検出することでその存在を判定できます。放射性同位体標識は、同位体標識の特殊なケースです。

これらの目的のために、特に有用なタイプの放射性崩壊は陽電子放出です。陽電子が電子と衝突すると、正反対の方向に移動する 2 つの高エネルギー光子が放出されます。陽電子が固体内で生成された場合、1 ミリメートル以上移動する前にこの状態になる可能性があります。^[要出典]これらの光子の両方を検出できれば、崩壊イベントの場所を非常に正確に特定できます。

厳密に言えば、放射性同位元素による標識は、実験者によって放射能が人工的に導入された場合のみに該当しますが、自然現象によっては同様の分析が可能な場合もあります。特に、放射年代測定は、密接に関連した原理を利用しています。

安定同位体トレーサーを用いたヒトのミネラル栄養と代謝の研究は、1960年代に初めて報告された。^[15]放射性同位体はそれ以前の数十年間もヒトの栄養研究に使用されていたが、安定同位体は、特に妊娠中や授乳中の女性、子供など放射線被曝の懸念が高い対象者にとっては、より安全な選択肢であった。安定同位体が提供するその他の利点には、適切な放射性同位体を持たない元素を研究できることや、トレーサーの長期的挙動を研究できることなどがある。^{[16] [17]}このように、同位体濃縮物質や無機質量分析計がますます利用可能になるにつれ、安定同位体の使用は一般的となった。放射性同位体の代わりに安定同位体を使用することには、いくつかの欠点がある。必要なトレーサーの量が多く、天然に存在するミネラルを乱す可能性がある。分析サンプルの準備がより複雑で、質量分析計の機器がより高価になる。全身または特定の組織におけるトレーサーの存在を外部から測定することはできない。^[18]それにもかかわらず、安定同位体はその利点により、ヒト研究の標準となっている。

人間の健康に必須で、栄養学の研究者が特に興味を持っているミネラルのほとんどは安定同位体を持っており、そのいくつかは天然存在比が低いため生物学的トレーサーとして適しています。^{[16] [18]} 鉄、亜鉛、カルシウム、銅、マグネシウム、セレン、モリブデンは、同位体トレーサー法が適用されている安定同位体を持つ必須ミネラルです。特に鉄、亜鉛、カルシウムは広範囲に研究されてきました。

研究対象となるミネラルの栄養/代謝の側面には、吸収（消化管から体内へ）、分布、貯蔵、排泄、およびこれらのプロセスの速度論が含まれます。同位体トレーサーは、被験者に経口（食事の有無にかかわらず、またはミネラルサプリメントと一緒に）および/または静脈内投与されます。その後、同位体の濃縮が血漿、赤血球、尿、および/または糞便で測定されます。^{[19] [20]}濃縮は母乳^[21]および腸の内容物でも測定されています。トレーサー実験の設計は、代謝の違いによりミネラル間で異なる場合があります。たとえば、鉄の吸収は通常、トレーサーが赤血球に取り込まれることで決定されますが、亜鉛やカルシウムの吸収は、血漿、尿、または糞便中のトレーサーの出現で測定されます。^{[22] [23]} 1回の研究で複数の同位体トレーサーを投与することは一般的であり、より信頼性の高い測定方法を使用したり、代謝の複数の側面を同時に調査したりすることができます。

食事からのミネラル吸収の測定は、しばしばバイオアベイラビリティとして考えられており、栄養研究における同位体トレーサー法の最も一般的な応用である。このような研究の目的には、食品の種類（植物性か動物性か、母乳か粉ミルクかなど）、食事のその他の成分（フィチン酸など）、病気や代謝障害（環境性腸管機能障害など）、生殖周期、食事中のミネラルの量、慢性的なミネラル欠乏、被験者の年齢、恒常性維持機構によって吸収がどのように影響を受けるかの調査などがある。あるミネラルについてこのような研究結果が得られれば、そのミネラルのヒトの生理学的および食事的必要量を推定するための基礎として役立つ可能性がある。^{[24] [25]}

トレーサーがミネラルの吸収と代謝を観察する目的で食品とともに投与される場合、それは内因性または外因性ラベルの形で行われる。^{[26] [27]}内因性ラベルは、食品の製造中に食品に導入された同位体であり、食品の天然ミネラル含有量を豊かにするのに対し、外因性ラベル付けは、研究中に食品にトレーサー同位体を追加することを指す。非常に時間と費用のかかるアプローチであるため、内因性ラベル付けは日常的に使用されていない。様々な食品の内因性および外因性ラベル付けを使用した吸収測定値を比較した研究では、一般的に2つのラベル付け方法の間で良好な一致が示されており、外因性および天然ミネラルがヒトの消化管内で同様に処理されるという仮説を支持している。

濃縮度は、質量分析法による同位体比（トレーサー同位体と参照同位体の比）の測定から定量化されます。濃縮度の定義と計算は、さまざまな研究者によって採用されています。 ^[28]複数のトレーサーを同時に使用すると、濃縮度の計算はより複雑になります。濃縮同位体調製物は同位体的に純粋になることはなく、つまり、元素のすべての同位体が不自然な量で含まれているため、複数の同位体トレーサーの濃縮度の計算では、他のトレーサーの存在による各同位体比の摂動を考慮する必要があります。^[28]

資源の乏しい国々ではミネラル欠乏症が蔓延しており、それが人々の健康と福祉に重大な影響を与えていることから、国際原子力機関は最近、安定同位体法の詳細かつ包括的な説明を発表し、この知識を西洋の学術センター以外の研究者にも広めることに努めている。^{[22] [29]}  

プロテオミクス（ゲノムによって発現されるタンパク質の完全なセットを研究する）では、疾患バイオマーカーを特定するために、細胞培養におけるアミノ酸による安定同位体標識（SILAC）の使用が必要になる場合があります。これは、タンパク質レベルの推定に使用される同位体標識されたアミノ酸の形態を提供します。^[30]タンパク質組み換えでは、操作されたタンパク質が大量に生成され、同位体標識は関連するタンパク質を検査するためのツールです。この方法は、核を¹³ Cまたは¹⁵ Nで選択的に濃縮するか、核から¹ Hを枯渇させるというものでした。組み換え体は、窒素源として¹⁵ N-塩化アンモニウムを含む培地を用いて大腸菌^{で発現されます。 [31]}得られた¹⁵ N標識タンパク質は、次に固定化金属親和性によって精製され、その割合が推定されます。標識タンパク質の収量を増やし、同位体標識培地のコストを削減するために、代替手順では、主に非標識培地を使用して細胞質量を増やしてから、それを最小量の標識培地に導入します。^{[32]同位体標識のもう一つの応用は、DNA合成、つまり}in vitroでの細胞増殖の測定です。H3-チミジン標識を使用して、_細胞内の合成パターン（または配列）を比較します。^[33]

同位体トレーサーは、自然システム、特に陸上および水生環境におけるプロセスを調べるために使用されます。土壌科学では、¹⁵ Nトレーサーが窒素循環の研究に広く使用されていますが、炭素の安定同位体と放射性同位体である¹³ Cと¹⁴ Cは、それぞれ有機化合物のターンオーバーと独立栄養生物によるCO ₂の固定の研究に使用されます。たとえば、Marshら（2005）は、二重標識（¹⁵ N​​-および^{14 C）}尿素を使用して、アンモニア酸化剤による化合物のエネルギー源（アンモニア酸化）と炭素源（化学独立栄養炭素固定）の両方としての利用を実証しました。^{[34]重水素化水は、樹木[35]または生態系[36]}内の水の運命と年齢を追跡するためにも使用されます。

トレーサーは海洋学でも、さまざまなプロセスを研究するために広く使用されています。使用される同位体は通常、発生源と生成および崩壊速度が確立された自然発生的なものです。ただし、人為的同位体も非常に効果的に使用できます。研究者は、さまざまな場所と時間で同位体比を測定し、海洋の物理的プロセスに関する情報を推測します。

海洋は粒子輸送の広範なネットワークです。トリウム同位体は、研究者が物質の垂直および水平方向の動きを解読するのに役立ちます。234 Th^は、海洋で一定かつ明確に定義された生成率を持ち、半減期は 24 日です。この天然の同位体は、深さとともに直線的に変化することが示されています。したがって、この直線パターンの変化は、粒子上の²³⁴ Th の輸送に起因する可能性があります。たとえば、表面水の同位体比が低く、数メートル下で非常に高い値は、下方向への垂直フラックスを示しています。さらに、トリウム同位体を特定の深さ内で追跡して、粒子の横方向の輸送を解読することもできます。^[37]

湾、河口、地下水などの局所的なシステム内の循環は、ラジウム同位体で調べることができます。223 Ra の半減期は 11 日で、河川や地下水源の特定の場所で自然に発生します。水源の川の水が湾や河口に入ると、ラジウムの同位体比は減少します。223 Ra の量をさまざまな場所で測定することで^、循環パターンを解読できます。^[38]これと同じプロセスを使用して、地下水の動きと排出を研究することもできます。^[39]

鉛のさまざまな同位体は、地球規模の循環を研究するために使用できます。異なる海洋（大西洋、太平洋、インド洋など）には、異なる同位体シグネチャがあります。これは、異なる海洋内の堆積物と岩石の同位体比の違いに起因します。^[40]鉛のさまざまな同位体の半減期は50〜200年であるため、同位体比が海洋全体で均一化されるには時間が足りません。したがって、Pb同位体比の正確な分析は、さまざまな海洋の循環を研究するために使用できます。^[41]

半減期が極めて長い同位体とその崩壊生成物は、地殻変動や極端な気候変動など、数百万年単位のプロセスを研究するために使用できます。たとえば、ルビジウム-ストロンチウム年代測定では、氷床コア内のストロンチウム同位体比（⁸⁷ Sr / ⁸⁶ Sr）を分析して、地球の生涯にわたる変化を調べることができます。氷床コア内のこの比率の違いは、地球の地球化学に大きな変化があることを示しています。^[41]

前述のプロセスは、天然の同位体を使用して測定できます。ただし、人為的同位体も海洋学の測定に非常に役立ちます。核兵器実験により、世界中の海洋に多くの珍しい同位体が放出されました。3 ^H、¹²⁹ I、¹³⁷ Cs は海水に溶解しており、²⁴¹ Am と²³⁸ Pu は粒子に付着しています。水に溶解した同位体は、地球規模の循環を研究するのに特に役立ちます。たとえば、海洋内の横方向の同位体比の違いは、強い水面または渦流を示している可能性があります。^[42]逆に、粒子に付着した同位体は、水柱内の物質輸送を研究するために使用できます。たとえば、Am または Pu のレベルが高い場合、深度で観察された場合は沈降を示し、表面で観察された場合は上昇を示します。 ^[43]

• 放射性核種の用途
• 生物学における放射能
• 放射性トレーサー
• アイソトポマー
• 同位体置換体
• 等圧標識
• 同位体希釈
• 金属カルボニルの赤外分光法

• 放射性標識化合物の合成