無菌動物

種子はエタノールや抗生物質溶液などの化学物質で表面殺菌され、無菌の植物が作られます。種子はその後、発芽するまで水または他の培地で育てられます。発芽後、種子は実験に使用するために、滅菌土壌または特定の微生物叢を含む土壌に移植されます。種子は土壌に直接移植して発芽させることもできます。植物を滅菌土壌に移植する場合、通常、2種類の栽培方法があります。1つは植物全体を滅菌状態に保つ方法、もう1つは根系のみを滅菌状態に保つ方法です。方法は実験の要件に基づいて選択されます。植物は隔離装置内で栽培され、隔離装置と植物が育つ土壌は頻繁に汚染がないかチェックされます。^{[ 6 ] [ 7 ]}

線虫は無菌状態で培養することもできます。研究に用いられる線虫C. elegansの無菌の子孫は、成虫を破裂させて卵を放出させることで得られます。この標準的な方法は、成虫を漂白剤溶液に浸すことです。漂白剤溶液は成虫を破裂させ、分解すると同時に卵を放出させ、表面を殺菌します。殺菌された卵は洗浄され、線虫の餌となる寒天培地のプレートに移されます。C . elegansは細菌を捕食するため、卵をプレートに移す前に、餌となる細菌を加熱または放射線照射によって殺菌する必要があります。この無菌線虫の作製方法には、線虫の年齢を同期させ、成長過程で全ての線虫がほぼ同じ年齢になるという利点もあります。通常、線虫は現在のプレート上の餌を全て消費するにつれて新しいプレートに移す必要があり、各プレートも同様に加熱または放射線照射処理されます。プレートは、覆いをして汚染源から隔離することで、外部からの汚染から保護することができる。^{[ 8 ]}

ショウジョウバエ、特にショウジョウバエ属は、最もよく使われるモデル生物の 1 つです。ショウジョウバエ属は主に遺伝学の分野で使われてきました。無菌または無菌のショウジョウバエを得るには 2 つの主な方法があります。その 1 つは卵を採取して卵膜を除去することです。卵膜は胚の周りの外膜です。無菌条件下で、卵は 0.6%次亜塩素酸ナトリウム溶液で 2.5 分間ずつ 2 回洗浄されます。次に、標本カップとともに 90 ml の漂白剤に入れられます。その後、滅菌水で 3 回洗浄されます。卵膜を除去した卵は、滅菌飼料の入ったバイアルに入れられます。^{[ 9 ]}

2つ目の方法は抗生物質の使用です。標準的な酵母コーンミール飼料などの培地に、ストレプトマイシンまたは抗生物質の組み合わせを添加します。抗生物質の濃度は400μg/mlです。酵母コーンミール飼料が冷めたら、1リットルの飼料に100mlのエタノールに10gのストレプトマイシンを溶解した溶液4mlを加えます。次に培地をバイアルに注ぎ、採れたての卵をバイアルに移します。^{[ 10 ]}

ゼブラフィッシュ（Danio rerio）は、無菌化できる生物医学研究で使用される動物モデルです^{[ 11 ]}。無菌ゼブラフィッシュを生成するためにゼブラフィッシュ胚を生産する最も簡単な方法は、自然交配です^{[ 12 ]}。しかし、自然交配では、配偶子は総排出腔を通過する際に成魚の腸内容物中の微生物に曝されます。配偶子の微生物への曝露を減らすために、手術によって成魚から卵子と精子を取り出し、体外受精によって胚を作成することができます。次に、胚は抗生物質、抗真菌剤、ポビドンヨード（PVP-I）、漂白剤を含む溶液で洗浄され、卵膜の表面が滅菌されます。その後、胚はアイソレーターに設置されたビーカー、またはインキュベーターに保管された滅菌細胞培養フラスコまたはマルチウェルプレートに移されます。ゼブラフィッシュは水生環境に生息するため、オートクレーブ滅菌されたゼブラフィッシュ培地で飼育する必要があり、廃棄物の蓄積を防ぐために滅菌培地は通常毎日交換されます。幼生が孵化すると、滅菌された餌が与えられます。実験では、無菌の幼生にゼブラフィッシュの腸から採取した微生物叢、または従来飼育された魚の培地を接種することができます^{[ 11 ] [ 12 ]}。

無菌鶏は通常、卵の段階で複数回の滅菌処理を受けます。これには、漂白剤または抗生物質溶液で卵の表面を洗浄して滅菌することが含まれます。卵は滅菌インキュベーターに移され、孵化するまでそこで育てられます。孵化すると、滅菌水とガンマ線照射された飼料が与えられます。これにより、腸管への異物微生物の侵入が防止されます。インキュベーターと動物の排泄物は、汚染の可能性がないか継続的に監視されます。通常、実験で使用する場合、既知の微生物叢が生後数日の動物に導入されます。この時点以降も汚染は監視され、管理されますが、微生物の存在は想定されます。^{[ 13 ] [ 14 ] [ 15 ]}

マウスは卵生期がないため、少し異なるプロセスを経ます。無菌マウスを作るには、体外受精によって胚を作り、無菌の母マウスに移植します。この方法が利用できない場合は、帝王切開でマウスを出産できますが、汚染のリスクが高くなります。このプロセスでは、無菌ではない母マウスを使用し、子マウスの出産前に母マウスを犠牲にして滅菌します。帝王切開後、子マウスは無菌の母マウスと一緒に滅菌インキュベーターに移され、授乳と成長が行われます。^{[ 16 ] [ 17 ]}これらの方法は、無菌マウス系統の作製にのみ必要です。系統が作製されると、汚染されない限り、すべての子孫は無菌になります。これらの子孫は、実験に使用できます。通常、実験では、マウス間の交差汚染を防ぐために、各マウスは滅菌アイソレーターで個別に飼育されます。マウスには汚染を防ぐために滅菌された餌と水が与えられます。マウスに与える餌や投与する薬剤が異なるため、実験ごとに滅菌方法が異なる場合があります。完全な滅菌状態を確保するために、隔離装置と廃棄物は汚染の可能性がないか継続的に監視されます。家禽と同様に、既知の微生物叢を動物に導入することができますが、汚染は依然として監視されます。^{[ 18 ] [ 19 ] [ 20 ]}

豚は大きさや生理機能、特に消化器系や循環器系の生理機能がヒトと似ているため、ヒトの健康と病気のモデルとして利用できることから、トランスレーショナルリサーチでの利用が増加している^{[ 21 ] [ 22 ]}。無菌豚を作るには、子豚がまだ中にいる子宮を子宮摘出術によって母豚から取り出し、隔離室に移して、無菌環境で子豚を取り出す^{[ 23 ] [ 24 ]}。子豚は隔離室で飼育され、無菌の固形飼料に切り替えるのに十分な年齢になるまで無菌のミルクを与えられる。無菌の子豚は、微生物が存在しないことを確認するために定期的に検査される。実験で使用するために、豚には豚またはヒトの微生物叢を定着させることができる^{[ 21 ] [ 23 ]}。

無菌動物は、マイクロバイオームの研究において因果関係を確立するために日常的に使用されています。^{[ 28 ] [ 29 ]}これは、標準的な共生腸内マイクロバイオームを持つ動物と無菌動物を比較するか、無菌動物に目的の微生物を定着させることによって行われます。腸内微生物叢は研究施設によって異なる場合があり、実験の交絡因子となり、再現性の欠如の原因となる可能性があります。^{[ 30 ]}無菌動物によく見られる主要な健康上の欠陥を修正し、再現可能な対照群として機能するいくつかの対照マイクロバイオームが開発されています。^{[ 31 ] [ 32 ]}無菌動物は、神経発達[33] 、寿命^{[ 34 ]} 、がん免疫療法^{[ 35 ]}、その他多くの健康関連の状況^{[ 36 ]}など、さまざまな状況で腸内マイクロバイオームの因果的役割を実証するために^{使用されてきました}。