ヒト網膜の遺伝子治療

網膜 遺伝子治療は、さまざまな形態の非遺伝性および遺伝性の失明の治療に有望である。

2008年、3つの独立した研究グループが、まれな遺伝性網膜疾患であるレーバー先天性黒内障の患者がアデノ随伴ウイルス（AAV）を用いた遺伝子治療で治療に成功したと報告しました。 ^{[1] [2] [3]} 3つの研究すべてにおいて、AAVベクターを使用してRPE65遺伝子の機能的なコピーを送達し、LCAを患う子供の視力を回復させました。これらの結果は遺伝子治療分野における成功と広くみなされ、網膜疾患におけるAAV媒介アプリケーションへの期待と勢いを生み出しました。

網膜遺伝子治療において、眼の遺伝子送達に最も広く使用されているベクターは、アデノ随伴ウイルスに基づいています。遺伝子治療にアデノ随伴ウイルスを使用する大きな利点は、免疫反応が最小限に抑えられ、さまざまな網膜細胞タイプで長期的な遺伝子発現を媒介することです。たとえば、血液網膜関門を形成するタイトジャンクションは、網膜下空間を血液供給から分離し、微生物からの保護を提供し、ほとんどの免疫介在性損傷を軽減します。^[4]

網膜ジストロフィーに関しては、まだ多くの知識が不足しています。知識を向上させるには、詳細な特徴付けが必要です。この問題に対処するために、レジストリの作成は、希少疾患をグループ化して特徴付ける試みです。レジストリは、これらの疾患のすべての表現型を特定して測定するのに役立ち、したがって、フォローアップを容易にし、科学者コミュニティに情報源を提供します。レジストリの設計は地域によって異なりますが、表現型の特定と特徴付けは標準的なものです。レジストリの例: RetMxMap<ARVO 2009>。2009 年以降に作成されたメキシコとラテンアメリカのレジストリ。このレジストリは、Adda Lízbeth Villanueva Avilés 博士によって作成されました。彼女は、メキシコと他のラテン諸国における遺伝性網膜ジストロフィーの遺伝子マッピングを行う臨床科学者です。

レーバー先天性黒内障（LCA）のマウスモデルにおける前臨床研究は1996年に発表され、イヌの研究は2001年に発表された。2008年には、3つのグループがLCAに対するアデノ随伴ウイルスを使用した臨床試験の結果を報告した。これらの研究では、 RPE65遺伝子をコードするAAVベクターが「網膜下注射」によって送達され、短時間の外科手術で少量の液体が網膜の下に注入された。^[5]開発は継続され、2017年12月、FDAはレーバー先天性黒内障を含む網膜ジストロフィーの原因となる両対立遺伝子RPE65遺伝子変異を持つ小児および成人に対するアデノ随伴ウイルスベクターベースの遺伝子治療薬であるVoretigene neparvovec （Luxturna）を承認した。この薬剤を眼内投与するには、生存可能な網膜細胞が前提条件となる。^[6]

LCA の臨床試験の成功に続き、研究者らはアデノ随伴ウイルスを用いた加齢黄斑変性(AMD) に対する同様の治療法の開発に取り組んできました。現在、研究は滲出型黄斑変性の治療にVEGF阻害剤の長期投与に焦点が当てられています。滲出型 AMD は現在、組み換えタンパク質を眼球に頻繁に注入して治療されていますが、これらの治療の目標は 1 回の投与で長期的な疾患管理を実現することです。そのような研究の 1 つが、オーストラリアのLions Eye Institute ^[7]で、米国を拠点とするバイオテクノロジーの新興企業 Avalanche Biotechnologies と共同で実施されています。別の初期段階の研究はGenzyme Corporationが後援しています。^[8]

イキソベロゲン ソロパルボベック（Ixo-vec）は、滲出型加齢黄斑変性（AMD）を標的とした治験中の硝子体内遺伝子治療であり、抗VEGF注射の頻度を減らすことで治療の負担を軽減することを目指しています。 ^[9] Ixo-vecは、 1回の硝子体内注射で投与され、AMD進行の鍵となる異常な血管の成長と体液漏出を制御する抗VEGFタンパク質であるアフリベルセプトの持続放出を可能にします。 ^[10] OPTIC試験とLUNA試験の結果は、長期間にわたる定期注射の必要性を大幅に減らすIxo-vecの有効性を実証しています。これらの試験の患者は、注射頻度が最大90％減少し、多くの患者が長期間注射を受けずに済みました。視力は安定しており、中心視野サブフィールド厚（CST）の減少などの解剖学的成果が達成されました。^[11]軽度の眼内炎症が最も一般的な副作用であり、ステロイド予防がこの問題の管理に効果的であることが証明されています。この治療法は、さらなる研究で証明されれば、AMD患者に頻繁な抗VEGF注射よりも便利で長期的な代替手段を提供し、生活の質と治療遵守を向上させる可能性があります。

2011年10月、脈絡膜ジストロフィーの治療のための最初の臨床試験が発表されました。^[12]試験を主導したオックスフォード大学のロバート・マクラーレン博士は、ロンドン大学インペリアル・カレッジのミゲル・シーブラ博士と共同で治療法を開発しました。この第1/2相試験では、網膜下AAVを使用して、罹患患者のREP遺伝子を修復しました。^[13] 試験の初期結果は、6人の患者全員の視力が改善したため有望であると2014年1月に報告されました。^{[14] [15]}

最近の研究では、AAVが成体サルの色覚を回復させ、色覚異常を治療できることが示されています。 ^[16]この治療法はまだ人間に対する臨床試験には入っていないものの、この研究は錐体光受容体を標的とする能力の画期的な進歩と考えられています。^[17]

脊椎動物の神経網膜は、いくつかの層と異なる細胞型で構成されています（ヒトの網膜の解剖を参照）。これらの細胞型の多くは網膜疾患に関係しており、緑内障で変性する網膜神経節細胞、光に反応し網膜色素変性症、黄斑変性症、その他の網膜疾患で変性する桿体および錐体光受容体、光受容体をサポートし網膜色素変性症および黄斑変性症にも関係する網膜色素上皮（RPE）などがあります。

網膜遺伝子治療では、AAVは細胞に入り込み、治療用DNA配列を発現させることで、さまざまな細胞タイプを「形質導入」することができます。網膜細胞は分裂しないため、AAVは数年にわたる長期間にわたって持続し、治療用DNA配列の発現を提供します。^[18]

AAV は網膜内の複数の細胞型に形質導入することができます。最もよく研​​究されている AAV のタイプである AAV 血清型 2 は、一般的に硝子体内または網膜下の 2 つの経路のいずれかで投与されます。硝子体内経路では、AAV は眼の硝子体液に注入されます。網膜下経路では、AAV は網膜の下に注入され、光受容体と RPE 層の間の潜在的な空間を短い外科手術で利用します。これは硝子体内経路よりも侵襲性が高いですが、液体は RPE に吸収され、網膜は 14 時間以内に合併症なく平坦化します。^[1]硝子体内 AAV は網膜神経節細胞といくつかのミュラーグリア細胞を標的とします。網膜下 AAV は光受容体と RPE 細胞を効率的に標的とします。^{[19] [20]}

異なる投与経路が異なる細胞タイプにトランスフェクトされる（例えば、異なる向性）理由は、内境界膜（ILM）とさまざまな網膜層が、薬物とベクターをより深い網膜層に送達するための物理的な障壁として機能するためです。 ^[21]したがって、全体として、網膜下AAVは、硝子体内経路を使用した送達よりも5〜10倍効率的です。

遺伝子送達における重要な要素の1つは、rAAVを介した遺伝子送達を狭めたり広げたりして組織内での効率を高めるために、改変された細胞向性を開発することです。カプシド構造などの特定の特性、細胞標的化戦略により、影響を受ける細胞の種類と遺伝子導入プロセスの効率を決定できます。さまざまな種類の改変を行うことができます。たとえば、AAV2カプシドが特定の細胞表面分子と相互作用できるようにする化学的、免疫学的、または遺伝学的変化による改変です。^[22]

網膜におけるAAVの初期研究では、AAV血清型2が使用されました。研究者らは現在、天然に存在するAAV血清型と改変されたAAV変異体に基づいて、AAVの新しい変異体の開発を開始しています。^[23]

網膜細胞に形質導入できるAAVの天然血清型がいくつか分離されている。硝子体内注射後、網膜神経節細胞に形質導入できるのはAAV血清型2と8のみであった。ミュラー細胞はAAV血清型2、8、9によって時折形質導入された。網膜下注射後、血清型2、5、7、8は光受容体に効率的に形質導入し、血清型1、2、5、7、8、9はRPE細胞に効率的に形質導入した。^[20]

改変された変異体の一例は最近、硝子体内注射後にミュラーグリアを効率的に形質導入し、攻撃的な常染色体優性網膜色素変性症の動物モデルの救済に使用されたことが報告されている。^{[24] [25]}

重要なのは、網膜は免疫特権を持っているため、AAVを注入しても重大な炎症や免疫反応は起こらないことです。^[26]遺伝子治療ベクターに対する免疫反応は、これまでの遺伝子治療の試みが失敗した原因であり、眼における遺伝子治療の重要な利点であると考えられています。再投与は大型動物で成功しており、長期にわたる免疫反応は発生しないことが示されています。^[27]

最近のデータでは、網膜下経路は硝子体内経路に比べて免疫特権の程度が高い可能性があることが示されています。^[28]

さまざまな網膜細胞タイプでの発現は、プロモーター配列によって決定できます。特定の細胞タイプに発現を制限するために、組織特異的または細胞タイプ特異的プロモーターを使用できます。

例えば、ラットでは、マウスロドプシン遺伝子がAAV2の発現を駆動し、GFPレポーター産物はラットの光受容体にのみ見られ、他の網膜細胞タイプや網膜下注入後の隣接するRPEには見られませんでした。一方、普遍的に発現している前初期サイトメガロウイルス（CMV）エンハンサープロモーターは、さまざまなトランスフェクトされた細胞タイプで発現します。ニワトリアクチンプロモーターとCMV前初期エンハンサーの融合であるCBAプロモーターなどの他の普遍的なプロモーターは、網膜下注入後にRPEと光受容体細胞の両方で安定したGFPレポーター発現を可能にします。^[29]

網膜組織における治療遺伝子の強力な恒常的発現は長期的な網膜機能に有害である可能性があるため、時にはトランスジーン発現の調節が必要になる場合があります。発現調節にはさまざまな方法が利用されています。1つの方法は、AAVベクターで外因的に調節可能なプロモーターシステムを使用することです。たとえば、テトラサイクリン誘導性発現システムでは、サイレンサー/トランスアクチベーターAAV2ベクターと、別の誘導性ドキシサイクリン応答性共注入を使用します。^{[29] [30]}経口ドキシサイクリンによって誘導が起こると、このシステムは光受容体細胞とRPE細胞の両方で遺伝子発現の厳密な調節を示します。

英国王立外科医師会（RCS）がラットモデルで行った研究では、受容体チロシンキナーゼ遺伝子 mertk の劣性変異により、未熟な終止コドンが発生し、RPE 細胞による貪食機能が損なわれることが示されています。この変異により、網膜下腔に外節の破片が蓄積し、光受容体細胞の死を引き起こします。この疾患のモデル生物に、CMV または RPE65 プロモーターの制御下にあるマウス Mertk cDNA を含む AAV 血清型 2 を網膜下注射しました。この治療により、光受容体細胞の生存が数ヶ月延長され^[31]、注射後 9 週間で AAV-Mertk で治療した眼では対照群と比較して光受容体の数が 2.5 倍増加し、網膜下腔の破片の量も減少していることが分かりました。

RPE65タンパク質はレチノイドサイクルで使用され、桿体外節内の全トランスレチノールが11-シス型に異性化され、11-シスレチナールに酸化されてから光受容体に戻り、オプシン分子と結合して機能的なロドプシンを形成します。^[32]動物ノックアウトモデル（RPE65-/-）では、遺伝子導入実験により、胎生14日目にヒトRPE65ベクターを早期に眼内送達すると、RPE65-/-ノックアウトマウスの網膜色素上皮に効率的に形質導入され、視覚機能が回復することが示されています。これは、病気の動物への早期の眼内送達が遺伝子治療の成功につながることを示しています。

若年性網膜分離症は、眼の神経組織に影響を及ぼす疾患である。この疾患は、中心黄斑領域のX連鎖劣性変性疾患であり、タンパク質レチノスキシンをコードするRSI遺伝子の変異によって引き起こされる。レチノスキシンは光受容体細胞と双極細胞で生成され、網膜のシナプスの完全性を維持するのに重要である。^[29]

具体的には、マウスオプシンプロモーターによって駆動される野生型ヒトRSI cDNAを含むAAV 5ベクターは、長期的な網膜機能および構造の回復を示した。また、網膜構造の信頼性は治療後に大幅に改善し、外核層の厚さの増加が特徴的であった。^[29]

網膜色素変性症は遺伝性疾患で、光受容細胞の死により進行性の夜盲症および周辺視力喪失を引き起こす。 ^{[29] [33] [34]網膜色素変性症を患う人のほとんどは、}桿体細胞が死んでいるか機能不全の状態を持って生まれ、そのため夜間は事実上盲目となる。桿体細胞は低光量での視力を司る細胞であるからである。それに続いて起こるのは、日中の光量で色覚と視力を司る錐体細胞の死であることが多い。錐体の喪失は早ければ5歳で完全な失明につながるが、何年も経ってから発症することもある。桿体細胞の欠損が錐体細胞の死につながる仕組みについては複数の仮説がある。網膜色素変性症のメカニズムを特定するのは困難である。なぜなら、この疾患と相関する遺伝子座と遺伝子が39以上あるためである。網膜色素変性症の原因を突き止めるために、それぞれの仮説に対処するためにさまざまな遺伝子治療技術が用いられてきた。^[35]

この疾患には、常染色体劣性、常染色体優性、X連鎖型など、さまざまな遺伝形式が考えられます。ロドプシンの主な機能は、光伝達カスケードを開始することです。オプシンタンパク質は光受容体の内節で作られ、外節に運ばれ、最終的にRPE細胞によって貪食されます。ロドプシンに変異が発生すると、タンパク質の折り畳み、安定性、細胞内輸送に影響を及ぼす可能性があるため、方向性のあるタンパク質の動きが影響を受けます。1つのアプローチは、変異mRNAを標的にして破壊するように設計されたAAV送達リボザイムを導入することです。^[29]

このシステムの仕組みは、変異ロドプシン遺伝子を持つ動物モデルで実証されています。注入されたAAVリボザイムはin vitroで最適化され、in vivoでP23H（最も変異が起こる場所）の変異mRNA転写物を切断するために使用されました。^[29]

ロドプシン構造タンパク質の別の変異、具体的には光受容体外節ディスクの形成に関与する膜糖タンパク質であるペリフェリン2は、ヒトで劣性RPおよび黄斑変性症を引き起こす可能性がある^[33] (19)。マウス実験では、ロドプシンプロモーターによって駆動される野生型ペリフェリン2遺伝子を運ぶAAV2が、網膜下注射によってマウスに送達された。その結果、ERG（網膜電図）によって検出された光受容体の構造と機能の改善が示された。結果は、ERGによって検出された光受容体の構造と機能の改善を示した。また、ペリフェリン2は、注射後2週間で網膜の外節層で検出され、注射後3週間で治療効果が認められた。注射後9か月で、ペリフェリン2とロドプシンの両方を含む明確な外節が存在した。^[29]

アポトーシスは、ほとんどの網膜ジストロフィーにおける光受容体の死の原因となり得るため、遺伝子置換療法では、突然変異が不明な場合は、生存因子と抗アポトーシス試薬が代替治療となり得ることが知られている。一部の科学者は、代替栄養因子を眼に注入することでこの問題を治療する実験を行った。ある研究者グループは、桿体由来錐体生存因子（RdCVF）タンパク質（Nxnl1（Txnl6）遺伝子によってコード化されている）を、最も一般的に発生する優性RP突然変異ラットモデルの眼に注入した。この治療は、錐体活動の生存を促進することに成功したことが実証されたが、この治療は、錐体の実際の機能を高めることによって、病気の進行を防ぐのにさらに重要な役割を果たした。^{[36]また、}グリア細胞株由来神経栄養因子（GDNF）のcDNAを含むAAV2ベクターを供給することで、桿体細胞に抗アポトーシス効果をもたらすかどうかを調べる実験も行われた。^{[29] [37]} 動物モデルを見ると、オプシントランスジーンにはC末端の最後の15アミノ酸が欠落した短縮タンパク質が含まれており、これが外節へのロドプシン輸送の変化を引き起こし、網膜変性につながる。 ^[29] AAV2-CBA-GDNFベクターを網膜下腔に投与すると、光受容体が安定化し、桿体光受容体が増加し、ERG分析の機能改善が見られました。^[37]毛様体神経栄養因子（CNTF）を使用した動物実験も成功しており、現在、CNTFはヒトの臨床試験で治療薬として使用されています。^[38]

眼血管新生（NV）は、眼球内の既存の血管か​​ら異常に新しい毛細血管が形成されることであり、糖尿病網膜症（DR）、未熟児網膜症（ROP）、（湿性）加齢黄斑変性（AMD）などの眼疾患の特徴である。これらの疾患の主な原因の1つはVEGF（血管内皮増殖因子）であり、血管漏出を誘発することが知られており、血管新生作用があることも知られている。^[29]正常組織では、VEGFは用量依存的に内皮細胞の増殖を刺激するが、そのような活性は他の血管新生因子では失われる。^[39]

多くの血管新生抑制因子は、局所VEGFの増加効果を打ち消すことが示されています。天然に存在する可溶性Flt-1は、ラット、マウス、サルの新生血管形成を逆転させることが示されています。^{[40] [41] [42] [43]}

色素上皮由来因子（PEDF ）も血管新生の阻害剤として作用する。低酸素状態ではPEDFの分泌が著しく減少し、VEGFの内皮細胞増殖活性が優位になるため、PEDFの減少が虚血誘発性NVの発症に中心的な役割を果たすことが示唆される。ある臨床所見では、ヒトの房水中のPEDFレベルは加齢とともに減少することが示されており、この減少がAMDの発症につながる可能性があることを示唆している。^{[29] [44]}動物モデルでは、CMVプロモーターの制御下にあるヒトPEDF cDNAを含むAAVが脈絡膜および網膜のNVを予防した^[45]（24）。

この発見は、AAVを介した血管新生抑制因子の発現がNVの治療に応用できることを示唆している。^{[46] [47]このアプローチは、組み換えタンパク質を眼に頻繁に注入する代わりに役立つ可能性がある。さらに、PEDFとsFlt-1は}強膜組織を介して拡散する可能性があり、 ^[48]眼内の投与部位に比較的依存しない可能性がある。

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