エクソームシークエンシング

エクソームシーケンシングは、全エクソームシーケンシング（WES ）とも呼ばれ、ゲノム（エクソームと呼ばれる）内の遺伝子のタンパク質コード領域全体をシーケンシングするゲノム技術です。^{[1]これは2つのステップで構成されます。最初のステップでは、}タンパク質をコードするDNAのサブセットのみを選択します。これらの領域はエクソンと呼ばれ、ヒトには約180,000のエクソンがあり、ヒトゲノムの約1％ 、つまり約3,000万塩基対を構成しています。2番目のステップでは、任意のハイスループットDNAシーケンシング技術を使用してエクソンDNAをシーケンシングします。^[2]

このアプローチの目標は、タンパク質配列を変化させる遺伝子変異を特定し、これを全ゲノム配列決定よりもはるかに低いコストで行うことにあります。これらの変異はメンデル遺伝性疾患とアルツハイマー病などの一般的な多遺伝子疾患の両方の原因となる可能性があるため、全エクソーム配列決定は学術研究と臨床診断の両方に応用されてきました。

エクソーム配列解析は、個人のすべての遺伝子の遺伝子変異を効率的に特定できるため、稀なメンデル遺伝病の研究に特に効果的です。これらの疾患は、ごく少数の個人にのみ存在する非常に稀な遺伝子変異によって引き起こされることがほとんどです。^{[3]対照的に、} SNPアレイなどの技術では、より広い集団の多くの個人に共通する共有遺伝子変異しか検出できません。^[4]さらに、重篤な疾患を引き起こす変異は、タンパク質コード配列に存在する可能性がはるかに高いため（ただし、排他的ではありません）、^{[5] [6]この1％に焦点を当てると、}全ゲノム配列解析よりもはるかにコストが低く、それでも関連する変異を高収量で検出できます。

過去には、臨床遺伝子検査は患者の臨床症状に基づいて選択されたり（つまり、特定の症候群に関連することが知られている1つの遺伝子または少数の遺伝子に焦点を当てたり）、特定の種類の変異のみを調査したり（比較ゲノムハイブリダイゼーションなど）、全患者の半数未満で確定的な遺伝子診断を提供したりしていました。^[7]エクソームシーケンシングは現在、これらの他の検査を補完するためにますます使用されています。これは、疾患を引き起こすことがすでにわかっている遺伝子の変異を見つけるためだけでなく、同様の特徴を持つ患者のエクソームを比較して新しい遺伝子を識別するためです。^[要出典]

ターゲットエンリッチメント法は、DNAサンプルから目的のゲノム領域を選択的に捕捉し、その後シーケンシングすることを可能にする。2005年にDGS法が初めて発表されて以来、いくつかのターゲットエンリッチメント戦略が開発されてきた。^[8]

標的捕捉のための多くの技術が説明されているが、そのうちエクソーム全体を捕捉するために拡張されたのはほんのわずかである。^[9]エクソーム全体の配列解析に適用された最初の標的濃縮戦略は、2007年のアレイベースのハイブリッド捕捉法であったが、近年では溶液中捕捉が普及してきている。

マイクロアレイには、ヒトゲノムの配列を持つ一本鎖オリゴヌクレオチドが表面に固定されて含まれている。ゲノムDNAは切断されて二本鎖断片を形成する。断片は末端修復されて平滑末端となり、ユニバーサルプライミング配列を持つアダプターが追加される。これらの断片はマイクロアレイ上のオリゴにハイブリダイズされる。ハイブリダイズしていない断片は洗い流され、目的の断片が溶出される。その後、断片はPCRを使用して増幅される。^{[10] [11]}

Roche NimbleGenは、オリジナルのDGS技術^[8]を次世代シーケンシングに適応させた最初の企業です。同社は、約180,000のコーディングエクソンをキャプチャするために、Sequence Capture Human Exome 2.1M Arrayを開発しました。^[12]この方法は、PCRベースの方法と比較して、時間と費用の両方を節約できます。Agilent Capture Arrayと比較ゲノムハイブリダイゼーションアレイは、ターゲットシーケンスのハイブリッドキャプチャに使用できる他の方法です。この技術の制限には、高価なハードウェアと比較的大量のDNAが必要であることが含まれます。^[13]

溶液内キャプチャを使用して関心のあるゲノム領域をキャプチャするには、カスタム オリゴヌクレオチド(プローブ) のプールを合成し、断片化されたゲノム DNA サンプルと溶液内でハイブリダイズします。プローブ (ビーズでラベル付け) は、関心のあるゲノム領域に選択的にハイブリダイズした後、ビーズ (関心のある DNA フラグメントを含む) を引き下げて洗浄し、余分な物質を除去します。次にビーズを取り除き、ゲノムフラグメントを配列決定して、関心のあるゲノム領域 (エクソンなど) の選択的なDNA 配列決定を可能にします。

この方法は、ハイブリダイゼーションキャプチャターゲットエンリッチメント法を改良するために開発されました。ソリューションキャプチャ（ハイブリッドキャプチャとは対照的に）では、必要なテンプレートの量を超えて、対象領域をターゲットとするプローブが過剰になります。^[13]最適なターゲットサイズは約3.5メガベースで、ターゲット領域の優れた配列カバレッジが得られます。推奨される方法は、対象領域内の塩基対の数、ターゲットの読み取りの需要、社内の機器など、いくつかの要因に依存します。^[14]

古典的なサンガー シーケンシング方法論の後に登場した、数多くの次世代シーケンシングシーケンシングプラットフォームが利用可能です。その他のプラットフォームには、Roche 454 シーケンサー、Life Technologies SOLiD システム、Life Technologies Ion Torrent、Illumina のIllumina Genome Analyzer II (廃止)、および後続の Illumina MiSeq、HiSeq、NovaSeq シリーズ機器があり、いずれも超並列エクソーム シーケンシングに使用できます。これらの「ショート リード」NGS システムは、ヒトのエクソンに見られるような、比較的短い DNA 配列を多数分析するのに特に適しています。

遺伝子変異を識別する技術は複数存在します。それぞれの技術には、技術的および経済的要因の点で長所と短所があります。そのような技術の 2 つが、マイクロアレイと全ゲノム配列解析です。

マイクロアレイは、ハイブリダイゼーションプローブを使用して既知のDNA配列の普及をテストするため、予期しない遺伝子変化を特定するために使用することはできません。^[13]対照的に、エクソームシーケンシングで使用されるハイスループットシーケンシング技術は、テストされた数千のエクソン遺伝子座のDNAのヌクレオチド配列を直接提供します。^{[15]したがって、WESはハイブリダイゼーション}ジェノタイピングアレイの現在の制限のいくつかに対処します。

エクソームシーケンシングはサンプル単位ではハイブリダイゼーションベースの技術よりも高価ですが、全ゲノムシーケンシングのコスト低下とスループットの向上により、そのコストは低下しています。^[要出典]

エクソームシーケンシングでは、タンパク質の機能に影響を与える遺伝子のコーディング領域に見られる変異のみを特定できます。疾患に関連する構造的変異や非コーディング変異を特定することはできませんが、これらは全ゲノムシーケンシングなどの他の方法を使用して見つけることができます。^[2]エクソームシーケンシングでカバーされていないヒトゲノムの99％が残っており、エクソームシーケンシングでは、全ゲノムシーケンシングと比較して少なくとも20倍のサンプルでゲノムの一部をシーケンシングできます。^{[2]特定された}まれな変異を臨床に応用するには、サンプルサイズと結果を解釈して臨床診断を提供する能力から、遺伝学の現在の知識では、診断を支援するためにエクソームシーケンシングが使用されているという報告があります。^[12]エクソームシーケンシングのコストは、通常、全ゲノムシーケンシングよりも低くなります。^[16]

シーケンシング手法から生成される大量のデータの統計分析は課題です。個人のエクソームをシーケンシングするだけでも、大量のデータと配列情報が生成され、かなりの量のデータ分析が必要になります。このデータの分析に関連する課題には、シーケンスリードをアラインメントおよびアセンブルするために使用されるプログラムの変更が含まれます。^[13]さまざまなシーケンシング技術には異なるエラー率があり、さまざまなリード長が生成されるため、異なるシーケンシングプラットフォームの結果を比較する際に課題が生じる可能性があります。

偽陽性および偽陰性の結果はゲノム再配列アプローチに関連しており、重大な問題です。エクソームデータの品質を向上させるために、次のようないくつかの戦略が開発されています。

• シーケンシングとアレイベースの遺伝子型解析で同定された遺伝子変異の比較^[2]
• コーディングSNPを、疾患を持つ全ゲノム配列解析された個体と比較する^[2]
• HapMap個体のコーディングSNPとサンガー配列の比較^[2]

稀な劣性疾患は、 dbSNPなどの公開データベースに一塩基多型（SNP）がない場合があります。より一般的な劣性表現型は、dbSNPで報告されている疾患原因変異を持つ可能性が高いです。たとえば、最も一般的な嚢胞性線維症変異は、ほとんどの集団で約3％の対立遺伝子頻度を持っています。このような変異をスクリーニングすると、誤ってそのような遺伝子が考慮から除外される可能性があります。劣性疾患の遺伝子は通常、優性疾患よりも特定しやすいです。これは、遺伝子が複数の稀な非同義変異を持つ可能性が低いためです。^[2]一般的な遺伝子変異をスクリーニングするシステムは、対立遺伝子の変異に関する正確な情報を持っていない可能性があるdbSNPに依存しています。研究エクソームまたはゲノムワイドで配列決定された個人からの一般的な変異のリストを使用する方が信頼性が高いでしょう。このアプローチの課題は、配列決定されたエクソームの数が増えるにつれて、dbSNPの珍しい変異の数も増えることです。疾患表現型と関連している可能性が低い一般的な変異を定義するための閾値を開発する必要があるだろう。^[15]

遺伝的異質性と集団の民族性も大きな制限であり、偽陽性と偽陰性の発見数が増加し、候補遺伝子の特定が困難になる場合があります。もちろん、異質性と民族性がある場合に閾値の厳しさを緩和することは可能ですが、これにより変異を検出する力も低下します。候補遺伝子を特定するために遺伝子型優先アプローチを使用することも、これらの制限を克服する解決策となる可能性があります。

一般的な変異解析とは異なり、全エクソーム配列解析研究における希少変異の解析では、単一の変異ではなく変異セットが評価されます。^{[17] [18]} 機能注釈は、希少変異の効果や機能を予測し、希少な機能変異の優先順位付けに役立ちます。これらの注釈を組み込むことで、全ゲノム配列解析研究における希少変異の遺伝的関連性解析の威力を効果的に高めることができます。^[19]機能注釈を組み込んで全エクソーム配列解析研究の解析を強化することで、機能に基づいた希少変異の関連性解析を実行するための方法やツールがいくつか開発されています。^{[20] [21]}

ゲノミクスの新技術は、研究者が基礎研究とトランスレーショナル研究の両方に取り組む方法を変えました。エクソームシーケンシングなどのアプローチにより、個々のゲノムから生成されるデータを大幅に強化することが可能となり、膨大な量の情報をどのように扱うべきかという一連の疑問が生じています。これらの研究の参加者は、自分のシーケンシング情報にアクセスできるようにすべきでしょうか？この情報は保険会社と共有すべきでしょうか？このデータは予期せぬ発見につながり、臨床的有用性と患者の利益を複雑にする可能性があります。ゲノミクスのこの分野は依然として課題が残っており、研究者はこれらの疑問にどのように対処するかを検討しています。^[15]

エクソーム シーケンシングを使用すると、固定コストの研究では、全ゲノム シーケンシングで達成できるよりもはるかに高い深さでサンプルをシーケンシングできます。この追加の深さにより、エクソーム シーケンシングは、信頼性の高い変異呼び出しを必要とするいくつかのアプリケーションに適しています。

現在の関連研究では、ゲノム全体にわたる一般的な変異に焦点が当てられています。これは、現在のアッセイで最も簡単に識別できるためです。ただし、候補遺伝子研究では、大きな影響を与える疾患原因変異がエクソーム内に存在することが判明しており、負の選択のために、はるかに低い対立遺伝子頻度で見つかり、現在の標準的なジェノタイピングアッセイでは型別されない可能性があります。全ゲノム配列決定は、ゲノム全体の新しい変異を検査する潜在的な方法です。ただし、複雑な障害（自閉症など）では、多数の遺伝子が疾患リスクに関連していると考えられています。^{[1] [22]}この根本的なリスクの不均一性は、遺伝子の発見に非常に大きなサンプルサイズが必要であることを意味し、したがって全ゲノム配列決定は特に費用対効果が高くありません。このサンプルサイズの問題は、遺伝子変異が変異レベルではまれであるにもかかわらず、疾患遺伝子を効果的にマッピングする新しい高度な分析方法の開発によって緩和されます。^[22]さらに、コーディング領域の変異はより広範囲に研究されており、その機能的意味を導き出すのがはるかに容易であるため、標的エクソーム領域内の変異の実用的応用がより迅速に可能となっている。

希少変異遺伝子の発見におけるエクソーム配列解析は、現在も非常に活発に研究が進められており、遺伝子セット全体にわたって大きなリスク負担が見られるという証拠が増えています。エクソーム配列解析により、自己免疫疾患である円形脱毛症におけるKRT82遺伝子の希少変異が報告されています。^[1]

メンデル遺伝性疾患の大きな影響については、これまでの研究結果から、コーディング遺伝子内の 1 つまたはごく少数の変異が、疾患全体の根底にあることが示唆されています。これらの疾患の重篤性のため、原因となる少数の変異は、集団内で極めてまれまたは新規であると推定され、標準的な遺伝子型判定アッセイでは見逃されるでしょう。エクソーム シーケンシングは、コーディング領域全体にわたって高いカバレッジの変異呼び出しを提供します。これは、真の変異をノイズから分離するために必要です。メンデル遺伝性疾患の発見の成功モデルには、親と発端者の遺伝子型を判定するトリオ シーケンシングを使用した de novo 変異の発見が含まれます。

2009年9月に発表された研究では、エクソームシーケンシングを使用して原因となる遺伝子変異を特定できるかどうかを判断するための概念実証実験について議論しました。彼らは、フリーマン・シェルドン症候群（FSS）（OMIM 193700）の患者4人のシーケンシングを行いました。FSSは、 MYH3遺伝子の変異によって引き起こされることが知られている、まれな常染色体優性疾患です。^[2] HapMap患者の8人もシーケンシングを行い、一般的な変異を除去して、FSSの原因遺伝子を特定しました。一般的な変異を除外した後、著者らはMYH3を特定することができ、エクソームシーケンシングを使用してまれな疾患の原因となる変異を特定できることが確認されました。^[2]これは、まれなメンデル遺伝性疾患の未知の原因遺伝子を特定する方法としてエクソームシーケンシングを使用した最初の研究報告でした。

その後、別のグループが、トルコ出身のバーター症候群の疑いのある患者の臨床診断に成功したと報告しました。 ^[12]バーター症候群は腎臓の塩分喪失疾患です。エクソーム配列解析により、先天性塩化物下痢（CLD）に関連するSLC26A3と呼ばれる遺伝子に、予期せぬよく保存された劣性変異が明らかになりました。このCLDの分子診断は、紹介した臨床医によって確認されました。この例は、未診断の遺伝性疾患の患者を評価するための臨床ツールとしての全エクソーム配列解析の使用の概念実証を提供しました。この報告は、患者の分子診断への次世代シーケンシング技術の初めての応用と見なされています。

2 番目の報告は、メンデル遺伝病であるミラー症候群(MIM#263750) の患者のエクソーム配列解析に関するもので、これは常染色体劣性遺伝の稀な疾患です。ミラー症候群の兄弟 2 人と血縁関係のない 2 人が研究対象となりました。非同義変異、スプライス アクセプターおよびドナー サイト、短いコーディング挿入または欠失など、病原性を持つ可能性のある変異が調べられました。^[3] ミラー症候群は稀な疾患であるため、原因となる変異はこれまで特定されていないと予想されます。公的な SNP データベースにある一般的な一塩基多型(SNP) の以前のエクソーム配列解析研究を使用して、候補遺伝子をさらに除外しました。これらの遺伝子を除外した後、著者らはミラー症候群の患者間で共有されているDHODHの変異を発見しました。ミラー症候群の各患者は、罹患した患者の両親がキャリアであることが判明したため、遺伝したDHODH変異の複合ヘテロ接合体でした。^[3]

これは、エクソーム シーケンシングによって、稀なメンデル遺伝病の原因となる新しい遺伝子が特定された初めての事例です。この興味深い発見は、エクソーム シーケンシングによって、従来の方法の限界によりこれまで不可能であった複雑な疾患の原因遺伝子を特定できる可能性があることを実証しています。標的捕捉と超並列シーケンシングは、個々のヒトゲノムにおけるタンパク質コードの変化を引き起こす変異を検出する、高い感度と特異性を備えた、費用対効果が高く、再現性があり、堅牢な戦略です。

エクソームシークエンシングは、患者の疾患の遺伝的原因を診断するために使用できます。基礎疾患遺伝子変異の特定は、診断および治療アプローチに大きな影響を与える可能性があり、疾患の自然史の予測を導き、リスクのある家族を検査することも可能になります。^{[2] [3] [12] [23 ] [24] [25]}エクソームシークエンシングが単一遺伝子解析よりも優れている理由は多数あり、非定型的な臨床症状のために検査されなかった遺伝子の変異を特定する能力^[25]や、異なる遺伝子の変異が同一患者の異なる表現型に寄与している臨床事例を特定する能力などが含まれます。^[3]

病気の遺伝的原因を診断すれば、この情報は適切な治療法の選択に役立つ可能性がある。この戦略が初めて臨床で成功裏に実施されたのは、炎症性腸疾患の乳児の治療であった。^{[24] [26]}これまでにもいくつかの従来の診断法が使用されていたが、その結果では乳児の症状を説明できなかった。エクソーム配列データの分析により、XIAP遺伝子の変異が特定された。この遺伝子の機能に関する知識が乳児の治療に役立ち、骨髄移植によって乳児の病気が治癒した。^[24]

研究者らは、エクソームシーケンシングを使用して、バーター症候群および先天性塩化物下痢の患者にみられる根本的な変異を特定した。^[12]ビルグラーのグループもエクソームシーケンシングを使用して、重度の脳奇形を患う患者にみられる根本的な変異を特定し、「[これらの発見は]、従来の方法では困難であることが判明した状況で、疾患遺伝子座を特定するために全エクソームシーケンシングを使用することを強調しています...私たちの結果は、この技術が、遺伝子座の異質性や診断分類の境界に関する不確実性によってマッピングが混乱している状況での遺伝子発見に特に価値があることを実証しており、医療への幅広い応用の明るい未来を示しています」と述べています。^[23]

南アフリカのケープタウン大学の研究者らは、エクソームシークエンシングを用いて、心臓病や心停止のリスクを高める不整脈性右室心筋症（ARVC）と呼ばれる遺伝性疾患の根本的な原因としてCDH2の遺伝子変異を発見した。[1]

複数の企業が消費者にエクソームシークエンシングを提供している。Knomeは消費者にエクソームシークエンシングサービスを提供した最初の企業である^{[いつ？ ]}。費用は数千ドルだった。^[27]その後、23andMeは2011年9月に発表され、2012年に中止されたパイロットWESプログラムを実施した。消費者は999ドルでエクソームデータを入手できた。同社は生データを提供したが、分析は提供しなかった。^{[27] [28] [29]}

2012年11月、 Gene by Geneの一部門であるDNADTCは、80Xカバレッジのエクソームを695ドルの導入価格で提供し始めました。^[30] DNADTCのウェブサイトによると、この価格は現在895ドルです。2013年10月、BGIは50Xカバレッジの個人向け全エクソームシーケンシングを499ドルで提供するプロモーションを発表しました。^[31] 2016年6月、Genosは唾液からシーケンシングされたCLIA認定の75X消費者エクソームで、さらに低価格の399ドルを実現しました。^{[32] [33] [34]}

2018年に36件の研究をレビューしたところ、エクソームシークエンシングのコストは555ドルから 5,169ドルの範囲で 、診断率は患者グループに応じて3％から79％の範囲であることがわかりました。^[16]

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