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電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）または移動度シフト電気泳動は、ゲルシフトアッセイ、ゲル移動度シフトアッセイ、バンドシフトアッセイ、またはゲル遅延アッセイとも呼ばれ、タンパク質-DNAまたはタンパク質-RNA相互作用を研究するために使用される一般的なアフィニティー電気泳動技術です。この手順により、タンパク質またはタンパク質の混合物が特定のDNAまたはRNA配列に結合できるかどうかを決定でき、結合複合体に複数のタンパク質分子が関与しているかどうかを示すことができます。ゲルシフトアッセイは、転写開始、DNAギャング複製、DNA修復またはRNAプロセシングと成熟、およびpre-mRNAスプライシングを研究する際に、 DNaseフットプリンティング、プライマー伸長、およびプロモータープローブ実験と同時にin vitroで実行されることがよくあります。 [ 1 ]以前の文献に前身が見られますが、現在のアッセイのほとんどは、GarnerとRevzin [ 2 ]およびFriedとCrothers [ 3 ]によって記述された方法に基づいています。
移動度シフトアッセイは、ポリアクリルアミドゲルまたはアガロースゲル上でタンパク質-DNAまたはタンパク質-RNA混合物を短時間（15～20cmのゲルで約1.5～2時間）電気泳動分離するものである。 [ 4 ]異なる分子（およびそれらの組み合わせ）がゲルを通過する速度は、そのサイズと電荷、そして程度は低いもののその形状によって決まる（ゲル電気泳動を参照）。コントロールレーン（タンパク質が存在しないDNAプローブ）には、結合していないDNAまたはRNA断片に対応する単一のバンドが含まれる。しかし、タンパク質が断片に結合できると仮定すると、結合するタンパク質が存在するレーンには、ゲル上で「シフト」した（よりゆっくりと移動したため）タンパク質に結合した、より大きく移動性の低い核酸プローブ複合体を表す別のバンドが含まれる。
適切な実験条件下では、DNA (または RNA) とタンパク質の相互作用が安定化され、ゲル上の結合核酸と非結合核酸の比率は、結合反応がゲルに入るときの遊離プローブ分子と結合プローブ分子の割合を反映します。この安定性は、ゲルマトリックスに囲まれたタンパク質が、再結合する前にプローブから拡散できないという「ケージング効果」による部分があります。[ 5 ]タンパク質とプローブの初期濃度が既知であり、複合体の化学量論が既知であれば、核酸配列に対するタンパク質の見かけの親和性を決定できます。[ 6 ]複合体がゲル条件下で非常に長く存続するか、電気泳動中の解離が考慮されない限り、得られる数値は見かけの Kd です。タンパク質濃度が不明だが複合体の化学量論が既知であれば、DNA プローブの濃度を、それ以上増加させても結合タンパク質の割合が増加しなくなるまで増加させることで、タンパク質濃度を決定できます。同じゲル上で泳動した一連の標準希釈遊離プローブと比較することにより、タンパク質のモル数を計算することができる。[ 4 ]
この混合物に、タンパク質を認識する抗体を加えることで、より大きな複合体を形成し、より大きなシフトを引き起こすことができる。この方法はスーパースシフトアッセイと呼ばれ、タンパク質－核酸複合体中に存在するタンパク質を明確に同定するために用いられる。
多くの場合、競合オリゴヌクレオチドを用いた追加レーンを泳動し、結合タンパク質にとって最も好ましい結合配列を決定します。配列が明確に定義された異なるオリゴヌクレオチドを使用することで、競合反応によって正確な結合部位を特定できます（図には示されていません）。競合アッセイのバリエーションは、結合の特異性や、結合および解離の速度論を測定するのに役立ちます。したがって、EMSAは、特定のタンパク質に実際に結合するオリゴヌクレオチドを選択するためのSELEX実験の一部としても使用できます。
in vitroでDNA-タンパク質結合が決定されたら、いくつかのアルゴリズムによって転写因子の同定のための探索範囲を絞り込むことができます。目的の転写因子のコンセンサス配列オリゴヌクレオチドは結合を競合することができ、シフトバンドを消失させるため、スーパースシフトによって確認する必要があります。予測されたコンセンサス配列が結合を競合しない場合、転写因子の同定はマルチプレックス競合EMSA（MC-EMSA）によって支援される可能性があります。MC-EMSAでは、多数のコンセンサス配列が各反応でマルチプレックス化され、1つのセットが結合を競合する場合、そのセットの個々のコンセンサス配列がさらに別の反応で実行されます。[ 7 ]
可視化の目的で、核酸断片は通常、放射性、蛍光性、またはビオチン標識で標識されます。標準的な臭化エチジウム染色法はこれらの方法よりも感度が低く、これらの実験で少量の核酸または一本鎖核酸が使用される場合、核酸を検出する感度が不足する可能性があります。ビオチン標識を使用する場合は、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素に結合したストレプトアビジンを使用してDNA断片を検出します。 [ 8 ] [ 9 ]同位体DNA標識はタンパク質結合親和性にほとんどまたは全く影響を与えませんが、蛍光色素やビオチンなどの非同位体標識を使用すると、目的のタンパク質相互作用の親和性および/または化学量論が変化する可能性があります。蛍光色素またはビオチン標識プローブと同一配列の非標識DNAとの競合を使用して、標識が結合親和性または化学量論を変化させるかどうかを判断できます。