逆相クロマトグラフィー

逆相液体クロマトグラフィー（RP-LC ）は、非極性固定相と極性移動相を用いて有機化合物を分離する液体クロマトグラフィーの一種です。 ^{[ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]}逆相モードでは、疎水性の高いサンプル成分がシステム内に長く保持されます。近年、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）を用いた分離および分析の大部分は、逆相モードで行われています。 ^{[ 4 ]}生体分子の分離のために最初に開発されたRP-LCは、現在では多くの固定相が使用可能で、分離方法の開発に大きな柔軟性をもたらす一般的な技術となっています。^{[ 5 ] [ 6 ]}

逆相液体クロマトグラフィー（RP-LC）において、成分の保持と分離に影響を与える要因はいくつかあります。

• 固定相の化学的性質。固定相は、異なる結合密度（表面積あたりに結合しているリガンドの数）でいくつかのリガンドでコーティングすることができます。
• 移動相の組成。移動相は、単一の溶媒、または複数の溶媒の混合物から構成されます。溶媒はさまざまな比率で混合できます。異なる移動相は、極性などの異なる特性を持ちます。移動相が主に単一の溶媒で構成され、少量の他の溶媒が添加されている場合、それらの他の溶媒は「移動相修飾剤」と呼ばれます。
• 移動相のpHは、溶質のイオン化状態と極性に影響を与えます。これは、緩衝液などの添加剤によって変更できます。

通常、固定相は、多孔質シリカゲル粒子の表面に結合した疎水性基質の層で構成されています。粒子は、球形、不規則形など様々な形状があり、直径も2、3、5、7、10 μm未満、細孔径も60、100、150、300 Åと様々です。粒子径はメッシュ数で表されることが多く、例えば2500メッシュは粒子径5 μmに相当します。疎水性基質は一般的にC3、C4、C8、C18などのアルキル鎖です。鎖が長いほど、サンプル成分の保持時間が長くなります。これにより分離能は向上しますが、クロマトグラフィーの実行時間も長くなります。現在、生体医療材料の分離には、ODS（オクタデシルシラン）やRP-18（逆相18）などの商品名で呼ばれるC18カラムが主に使用されています。

一般的なシリカ系逆相カラムは、中程度のpH範囲で最も優れた性能を発揮します。pHが非常に低い場合や高い場合、シリカ表面や結合した疎水性層が劣化する可能性があります。非常に酸性またはアルカリ性の条件下での逆相液体クロマトグラフィー（RP-LC）には、疎水性ポリマー粒子、あるいはシリカと有機基をハイブリッド化した粒子を用いることができます。

疎水性高分子粒子は、シリカではなく有機高分子から作られています。一般的な例としては、ポリスチレン-ジビニルベンゼン（PS-DVB）が挙げられます。粒子自体が疎水性であるため、有機化合物が直接吸着することができます。

純粋なシリカはアルカリ性条件下で溶解します。シリカと有機物のハイブリッド粒子は、シリカ単位と有機基の両方を含む骨格を持つ粒子です。典型的な構造は、Si–O–SiとSi–R–Siの混合構造で、Rはエチレン基などの有機リンカーです。これにより、粒子はアルカリ性条件下でより耐性を持つようになります。

移動相は、水と極性有機溶媒（通常はメタノールとアセトニトリル）の混合物です。これらの混合物には、緩衝剤（酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液）、界面活性剤（アルキルアミンまたはアルキルスルホン酸塩）、特殊添加剤（EDTA）などの様々な添加剤が含まれています。これらの添加剤を使用する目的は、効率、選択性を向上させ、溶質の保持を制御することです。

逆相固定相の歴史と進化については、Majors、Dolan、Carr、Snyderによる論文で詳しく説明されています。^{[ 7 ]}

1970年代には、ほとんどの液体クロマトグラフィーは、未修飾シリカゲルまたはアルミナからなる固体粒子を固定相として使用して行われていました。この種の技術は現在、順相クロマトグラフィーと呼ばれています。順相クロマトグラフィーでは、固定相は親水性であり、移動相はヘキサンやヘプタンなどの有機溶媒からなる非極性/疎水性です。

しかし、順相クロマトグラフィーは多くの生体分子には適していないため、逆相クロマトグラフィーが開発された。具体的には、多くの生体分子は極性を持つため、非極性の移動相にはうまく溶解しない。

逆相クロマトグラフィーでは、移動相は極性であり、親水性分子をよく溶解します。非極性の固定相と極性の移動相を使用することは、移動相と固定相の極性が反転しているため、基本的に順相クロマトグラフィーの逆であり、そのため逆相クロマトグラフィーと呼ばれます。^{[ 8 ] [ 9 ]}その結果、極性の移動相中の疎水性分子は疎水性の固定相に吸着する傾向があり、サンプル中の親水性分子はカラムを通過して最初に溶出されます。^{[ 8 ] [ 10 ]}疎水性分子は、有機（非極性）溶媒を使用して移動相の極性を低下させることでカラムから溶出できます。これにより疎水性相互作用が減少します。分子の疎水性が高いほど、固定相への結合が強くなり、分子を溶出するために必要な有機溶媒の濃度が高くなります。

細孔の大きさも影響します。細孔の小さい粒子は、大きな分子がその粒子の表面積の大部分にアクセスできないようにします。つまり、化学的に類似していても、大きな分子は小さな分子よりも保持時間が短くなります。

クロマトグラフィー理論の数学的パラメータや、他のクロマトグラフィー法で使用される実験的考察の多くは、RP-LCにも適用されます（例えば、選択性係数、クロマトグラフィー分離度、理論段数など）。^{[ 11 ]}

シリカ系固定相

シリカゲル粒子は、いくつかの理由から、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）の固定相として一般的に使用されています。^{[ 13 ] [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ]}

1. シリカゲル粒子は、溶質との相互作用や配位子との結合が起こるための表面積が大きい。
2. シリカゲルは、多くの種類の溶媒や分析対象物と反応しない。
3. シリカゲルは様々な官能基で修飾することができる。
4. シリカゲルは安価だ。
5. シリカゲル粒子は、特定の直径、形状、細孔サイズなどに容易に加工できる。

シリカ粒子はさまざまな形状をとることができます。粒子は完全に固体（「モノリシック」または「溶融」）、穴だらけ（「多孔質」）、または固体のコアと多孔質のシェルを持つ（「表面多孔質」）場合があります。粒子はさまざまな直径を持つことができます。細孔はさまざまな直径を持つことができます。^{[ 17 ]}

米国薬局方（USP）は、HPLCカラムをL#タイプで分類しています。^{[ 18 ]}この分類で最も一般的なカラムは、オクタデシル炭素鎖（C18）結合シリカ（USP分類L1）です。^{[ 19 ]}これに続いて、C8結合シリカ（L7）、純粋シリカ（L3）、シアノ結合シリカ（CN）（L10）、フェニル結合シリカ（L11）があります。C18、C8、フェニルは逆相固定相専用ですが、CNカラムは分析対象物と移動相条件に応じて逆相モードで使用できることに注意してください。すべてのC18カラムが同じ保持特性を持つわけではありません。シリカの表面官能化は、モノマー反応またはポリマー反応で実行でき、2段階目では、残りのシラノール基を覆うために異なる短鎖有機シランが使用されます（末端キャッピング）。全体的な保持メカニズムは同じであるものの、異なる固定相の表面化学における微妙な違いが選択性の変化につながる。

現代のカラムは、固定相に結合したリガンドによって極性が異なります。PFPはペンタフルオロフェニルです。CNはシアノです。NH2はアミノです。ODSはオクタデシルまたはC18です。ODCNはC18とニトリルからなる混合モードカラムです。^{[ 20 ]}

RP-LCの移動相は、水または水性緩衝液の混合物で構成され、これにさらに溶媒が添加され、逆相カラムから分析対象物を選択的に溶出させます。^{[ 8 ] [ 21 ]}添加される溶媒は水と混和性でなければなりません。これらは移動相の極性を変化させるため、「修飾剤」とも呼ばれます。水は逆相移動相の中で最も極性の高い溶媒です。移動相の溶出強度を高めるために、通常は修飾剤を添加して極性を下げます。一般的な修飾剤には、アセトニトリル（ACN）、メタノール（MeOH）、2-プロパノール（イソプロパノール、IPA）、エタノール（EtOH）、テトラヒドロフラン（THF）などがあります。

• 水性順相クロマトグラフィー

• Boyes, Barry; Dong, Michael (2018). "逆相クロマトグラフィーにおける移動相選択の最新動向とベストプラクティス" . LCGC North America . LCGC North America-10-01-2018. 36 (10): 752– 768.

• 逆相の種類をまとめた表、および官能基化プロセスに関する情報