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温度勾配ゲル電気泳動（TGGE）と変性勾配ゲル電気泳動（DGGE ）は、試料がアクリルアミドゲル上を移動する際に、温度勾配または化学勾配を用いて試料を変性させる電気泳動法です。TGGEとDGGEは、 DNAやRNAなどの核酸、そして（あまり一般的ではありませんが）タンパク質にも適用できます。TGGEは、核酸を分離するために、温度依存的な構造変化を利用します。DGGEは、塩基配列によって決まる変性能力の違いに基づいて、同じサイズの遺伝子を分離します。DGGEは元々の手法であり、TGGEはその改良版です。
DGGEは、SUNY Albanyの教授であったLeonard Lermanによって発明されました。 [ 1 ] [ 2 ] [ 3 ]
同じ装置を使ってタンパク質の分析も行うことができ、これはイギリスのケンブリッジにあるMRC分子生物学研究所のトーマス・E・クレイトンによって初めて行われた。[ 4 ]タンパク質と核酸は似たようなパターンを生成するが、その基本原理は全く異なる。
TGGEは、ThatcherとHodson [ 5 ]およびジョージア工科大学のRoger Wartellによって初めて記述されました。ドイツのRiesnerグループによって広範な研究が行われました。DGGE用の市販機器はBio-Rad、INGENY、CBS Scientificから入手可能で、TGGE用のシステムはBiometraから入手可能です。
DNAは負電荷を帯びているため、電場中では正極に向かって移動します。ゲルは分子メッシュであり、その穴の大きさはDNA鎖の直径とほぼ同じです。電場を印加すると、DNAはゲル中を移動し始めますが、その速度はDNA分子の長さにほぼ反比例します（DNAが短いほど速く移動します）。これが、標準的な電気泳動におけるサイズ依存分離の原理です。
TGGEでは、ゲル全体に温度勾配も存在します。室温では、DNAは二本鎖の形で安定して存在します。温度が上昇すると、鎖が分離し始め（融解）、ゲル内を移動する速度が著しく低下します。重要なのは、融解が起こる温度は配列に依存するということです（GC塩基対は、水素結合の違いではなく、スタッキング相互作用によりATよりも安定しています（シトシンとグアニンの塩基対間には3つの水素結合がありますが、アデニンとチミンの間には2つしかありません））。そのため、TGGEはDNA分子を分離するための「配列依存的かつサイズ非依存的な方法」を提供します。TGGEは分子を分離し、融解挙動と安定性に関する追加情報を提供します。[ 6 ]
変性勾配ゲル電気泳動（DGGE）は、変性剤を含む電気泳動ゲルに少量のDNA（またはRNA）サンプルを適用することで機能します。研究者たちは、特定の変性ゲルが様々な段階でDNAを融解させる能力があることを発見しました。この融解の結果、DNAはゲル全体に広がり、200～700塩基対という小さなものも含め、個々の成分を分析することができます。
DGGE法のユニークな点は、DNAがますます極端な変性条件にさらされるにつれて、融解した鎖が完全に一本鎖に断片化されることです。変性ゲル上での変性プロセスは非常に急激です。「連続的なジッパーのように部分的に融解するのではなく、ほとんどの断片は段階的なプロセスで融解します。断片の離散的な部分またはドメインは、非常に狭い範囲の変性条件内で突然一本鎖になります」（Helms、1990）。[ 7 ]これにより、DNA配列の違いやさまざまな遺伝子の変異を識別することが可能になります。同じ長さの断片の配列の違いは、多くの場合、勾配内の異なる位置で部分的に融解し、したがってゲル内の異なる位置で「停止」します。変性勾配ゲル上で多型DNA断片の融解挙動を並べて比較することにより、最初の融解ドメインに変異を持つ断片を検出することが可能です（Helms、1990）。標準的な DGGE では最も融解度の高い領域を十分にカバーできないため、アッセイでは 1 つの PCR プライマーに GC リッチ クランプを追加して、完全な鎖解離を防ぎ、フラグメントのより融解度の高い領域の変異を検出できるようにすることもあります。[ 8 ] [ 9 ] 2 つのサンプルをゲル上に並べて一緒に変性させることで、研究者は 2 つのサンプルまたは DNA フラグメントのごくわずかな違いでも簡単に見ることができます。
この手法にはいくつかの欠点がある。「DGGEで使用されるような化学勾配は再現性が低く、確立が難しく、ヘテロ二本鎖を完全に分離できない場合が多い」（Westburg、2001）。これらの問題は、化学勾配ではなく温度勾配を用いて試料を変性させるTGGEによって解決される。
TGGE で核酸を分離するには、ゲルを準備して流し込み、電気泳動、染色、DNA の溶出という手順を実行する必要があります。緩衝系を選択する必要があるため、温度上昇の状況下でシステムが安定していることが重要です。そのため、ゲルの準備には通常尿素が使用されますが、研究者は使用する尿素の量が DNA を分離するために必要な全体の温度に影響することを認識する必要があります。[ 6 ]ゲルをロードし、実行しているゲルの種類 (平行または垂直) に従ってサンプルをゲル上に置き、電圧を調整してサンプルを実行させることができます。[ 6 ]実行する TGGE の種類 (垂直または平行)に応じて、準備してロードする必要があるサンプルの量も異なります。垂直 TGGE では 1 つのサンプルを多く使用し、平行 TGGE では多くのサンプルを少量使用します。ゲルを実行したら、結果を視覚化するためにゲルを染色する必要があります。この目的に使用できる染色剤はいくつかありますが、銀染色が最も効果的なツールであることが証明されています。[ 6 ] DNAは銀染色から溶出され、PCR増幅によってさらに分析することができます。[ 6 ]
TGGEとDGGEは、生物医学および生態学研究において幅広く有用であり、以下にその代表的な応用例を説明する。
Wong、Liang、Kwon、Bai、Alper、Gropmanによる最近の調査[ 10 ]によると、TGGEは個人のミトコンドリアDNAを調べるために利用できる。これらの著者によると、TGGEはミトコンドリアゲノムの2つの新規変異を特定するために使用された。「ミトコンドリア細胞障害が疑われているが、一般的なミトコンドリアDNA（mtDNA）点変異および欠失が陰性である21歳の女性について、温度勾配ゲル電気泳動によりミトコンドリアゲノム全体の未知の変異をスクリーニングした」 [ 11 ] 。
Lohr らは (2001)、膵臓癌のない個人の膵液分泌物の包括的な研究において、参加者のごく一部の膵液中にp53変異が見つかったと報告している。 [ 12 ] p53 の変異は膵臓癌で広く見つかっているため、この研究の研究者らは、変異自体が膵臓癌の発症と関連しているかどうかを判断しようとしていた。Lohr は TGGE により数人の被験者で p53 変異を見つけることができたが、その後膵臓癌を発症した人はいなかった。したがって、研究者らは、p53 変異は膵臓癌の発癌の唯一の指標ではない可能性があると結論付けている。
小リボソームサブユニットコード遺伝子のDGGEは、ライデン大学のポスドクであったジェラール・ムイザー[ 13 ]によって初めて記述され、微生物生態学において広く用いられる技術となった。
混合微生物群集から抽出したDNAを、細菌および古細菌の16S rRNA遺伝子断片、ならびに真核生物の18S rRNA遺伝子断片に特異的なPCRプライマーを用いてPCR増幅すると、PCR産物の混合物が得られる。これらの増幅産物はすべて同じ長さであるため、アガロースゲル電気泳動では分離できない。しかし、異なる微生物rRNA間の配列変異（すなわち、GC含量および分布の違い）により、これらのDNA分子の変性特性が異なってくる。
したがって、DGGE バンドパターンは、微生物の遺伝的多様性の変動を視覚化し、優勢な微生物群集メンバーの豊富さの概算値を提供するために使用できます。この方法は、しばしばコミュニティ フィンガープリンティングと呼ばれます。最近のいくつかの研究では、機能遺伝子 (硫黄還元、窒素固定、アンモニウム酸化に関与する遺伝子など) の DGGE が、微生物の機能と系統発生に関する情報を同時に提供できることが示されています。たとえば、Tabatabaei ら (2009) は DGGE を適用し、パーム油工場排水 (POME) の嫌気性発酵中の微生物パターンを初めて明らかにすることに成功しました。[ 14 ]
{{cite journal}}: CS1メンテナンス: DOIは2025年7月現在非アクティブです（リンク）