配列飽和突然変異

配列飽和突然変異誘発（SeSaM）は、タンパク質および酵素の指向性進化に適用される化学酵素ランダム突然変異誘発法である。^[要出典]これは最も一般的な飽和突然変異誘発技術の1つである。4つのPCRベースの反応ステップで、ホスホロチオエートヌクレオチドが遺伝子配列に挿入され、切断され、結果として生じる断片がユニバーサルヌクレオチドまたは縮重ヌクレオチドによって伸長される。次に、これらのヌクレオチドは標準ヌクレオチドに置き換えられ、遺伝子配列全体に広がる核酸突然変異の広範な分布が可能になり、転座が優先され、連続する点突然変異に独特の焦点が当てられます。これらはどちらも他の突然変異誘発技術では生成が困難です。この技術は、ブレーメンのヤコブス大学とアーヘン工科大学のウルリッヒ・シュヴァーネベルク教授によって開発されました。

SeSaM は、単純なエラーを起こしやすい PCR (epPCR) 技術に基づく標準的な突然変異誘発法で作業する際に遭遇するいくつかの主要な制限を克服するために開発されました。これらの epPCR 技術はポリメラーゼの使用に依存しているため、主に単一の、しかし非常にまれに連続した核酸^[要出典]置換のみが実行され、これらの置換は通常特定の好ましい位置でのみ発生するという状況から生じる制限に遭遇します。さらに、核酸の転座は遷移よりもはるかに可能性が低く、変更されたバイアスを持つ特別に設計されたポリメラーゼが必要です。^[1] epPCR が触媒する核酸交換のこれらの特性は、遺伝コードが退化しているという事実と相まって、アミノ酸レベルでの結果として生じる多様性を減少させます。同義置換はアミノ酸の保存につながるか、サイズや疎水性などの同様の物理化学的特性を持つ保存的変異が広く普及しています。^{[2] [3]} SeSaMは、遺伝子配列のあらゆる位置にユニバーサル塩基を非特異的に導入することで、特定の位置での一時的な置換を好むポリメラーゼバイアスを克服し、遺伝子配列全体を多様なアミノ酸交換に開放します。^[4]

SeSaM法の開発中に、複数の変異を同時に導入できるいくつかの改良が導入されました。^{[5]この方法のもう1つの進歩は、ユニバーサル}イノシンの代わりに縮重塩基を導入し、最適化されたDNAポリメラーゼを使用することで達成され、導入された転座の比率がさらに増加し​​ました。^[6]この改良されたSeSaM-TV+法では、さらに2つの連続したヌクレオチド交換の導入が可能になり、置換できるアミノ酸の範囲が大幅に広がりました。

SeSaM-TV-II法のステップIIIでの 改良キメラポリメラーゼの適用^{[7] [8]}、チミンとシトシン塩基の効率的な置換のための代替縮重ヌクレオチドの追加、SeSaM-P/Rでの変異頻度の増加など、いくつかの最適化により、^[9]生成されたライブラリはトランスバージョン数に関してさらに改善され、連続変異の数は2～4連続変異に増加し、連続変異率は最大30%になりました。^[10]

SeSaM 法は、2 ～ 3 日以内に実行できる PCR ベースの 4 つのステップで構成されています。主な部分には、ホスホロチオエート ヌクレオチドの組み込み、これらの位置での化学的断片化、ユニバーサルまたは縮重塩基の導入、および点突然変異を挿入する天然ヌクレオチドによるそれらの置換が含まれます。

まず、目的の遺伝子の前後に遺伝子特異的プライマーを結合させ、ユニバーサルな「SeSaM」配列をPCRで挿入します。目的の遺伝子とその隣接領域を増幅して、これらのSeSaM_fwd配列とSeSaM_rev配列を導入し、後続のPCRステップのテンプレートを生成します。

生成されたいわゆる fwd テンプレートと rev テンプレートは、挿入された変異が遺伝子の全長にわたって均一に分布するように、事前に定義されたホスホロチオエートと標準ヌクレオチドの混合物を使用した PCR 反応で増幅されます。ステップ 1 の PCR 産物はホスホロチオエート結合で特異的に切断され、ユニバーサル プライマーから始まるさまざまな長さの一本鎖 DNA 断片のプールが生成されます。

SeSaM のステップ 2 では、末端デオキシヌクレオチド転移酵素(TdT)の触媒作用により、DNA 一本鎖が 1 個から数個のユニバーサル塩基または縮重塩基 (適用された SeSaM の修飾によって異なります) だけ伸長されます。このステップは、特徴的な連続変異を導入してコドン全体をランダムに変異させるための重要なステップです。

続いて、ステップ 3 では、一本鎖 DNA 断片を対応する全長逆テンプレートと組み換える PCR が実行され、その配列にユニバーサル塩基または縮重塩基を含む全長二本鎖遺伝子が生成されます。

SeSaM ステップ 4 で遺伝子配列内のユニバーサル/縮重塩基をランダムな標準ヌクレオチドに置き換えることにより、大量の転座とそれに続く置換変異を含む、置換変異を持つ全長遺伝子配列の多様な配列が生成されます。

SeSaM は、アミノ酸レベルでタンパク質を直接最適化するために使用されるだけでなく、理想的なアミノ酸交換のための飽和突然変異誘発をテストするためのアミノ酸の位置を予備的に特定するためにも使用されます。SeSaM は、イオン液体耐性のためのセルラーゼ、^[11]洗剤耐性が向上したプロテアーゼ、^[12]分析用途のグルコースオキシダーゼ、^[13]耐熱性が向上したフィターゼ^[14]および代替電子供与体を使用して触媒効率が向上したモノオキシゲナーゼなど、選択された特性に向けた酵素の改善を目的とした、さまざまなクラスの酵素の多数の指向性進化キャンペーンにうまく適用されています。^{[15] SeSaM は、13 か国以上で US770374 B2 によって特許保護されており、} SeSaM-Biotech GmbHのプラットフォーム技術の 1 つです。