光活性化プローブ

光活性化プローブ、またはケージドプローブは、光のフラッシュによって活性化できる細胞プレーヤー（タンパク質、核酸、小分子）です。これらは、細胞内のプロセスを研究するための生物学研究で使用されます。基本原理は、光活性化剤（光応答性基で修飾された小分子、人工光受容体タンパク質でタグ付けされたタンパク質など）を細胞、組織、または生きた動物に持ち込み、照明によってその活動を特異的に制御することです。^[1]

光は非侵襲性であり、正常な細胞プロセスに影響を与えないため、これらのタイプの実験に適した外部トリガーです（ただし、スペクトルの紫外線部分の光を使用する場合は、 DNA損傷を回避するために注意が必要です）。さらに、光は高度な空間的および時間的制御を提供します。通常、活性化刺激はレーザーまたはUVランプから得られ、効果のモニタリングに使用される同じ顕微鏡に組み込むことができます。これらすべての利点により、多種多様な光活性化プローブが開発されました。

光誘導活性化ステップは通常は不可逆的ですが、多くの光スイッチでは可逆的な変化が誘導されます。

光保護類似体が生物学研究に使用された最初の報告は、1978年にジョセフ・F・ホフマンがNa:Kポンプの研究でケージドATPを合成し応用したことでした^[2]。2013年の時点でも、ATPは最も一般的に使用されているケージド化合物です。ホフマンは、このタイプの修飾分子に「ケージド」という用語を作り出した人物でもあります。この命名法は、分子が物理的なケージ（フラーレンのように）内にあるという考えを示唆するため、科学的には誤った名称であるにもかかわらず、存続しました。しかし、科学者たちは、より正確な新しい用語「光活性化プローブ」を導入しようと試みました。現在、両方の命名法が使用されています。

その後の数年間で、哺乳類の脳切片の機能的神経回路をマッピングするために使用されるグルタミン酸などのケージド神経伝達物質に関する大きな発見がなされました。^[3]小さな分子は、タンパク質などの大きな構造と比較して、光分解性基によって修飾する方が簡単です。光活性化タンパク質は、ずっと後になって（2002年）、Kaedeタンパク質をベンチに置いて日光にさらすと蛍光がより長い波長に変化するという観察によって偶然発見されました。^[4]

光を感知して反応するタンパク質は、もともと藻類、サンゴ、その他の海洋生物の光受容体から単離されました。2013年現在、科学研究で最も一般的に使用されている2つの光活性化タンパク質は、光活性化蛍光タンパク質とレチニリデンタンパク質です。光活性化蛍光タンパク質は、紫外線を照射すると発光波長が長くなります。Kaedeでは、この変化はクロモフォアトリペプチドHis62-Tyr63-Gly64の切断によって引き起こされます。^[5]この発見は、 PALMやSTORMなどの現代の超解像顕微鏡技術への道を開いた。チャネルロドプシンやハロロドプシンなどのレチニリデンタンパク質は、光に敏感なカチオンチャネルと塩素チャネルであり、それぞれ青色光と黄色光が照射されているときに開きます。この原理は、生きた細胞や組織のニューロンの活動を制御するためにうまく利用されており、光遺伝学というまったく新しい研究分野を生み出しました。

核酸は、細胞情報の保存と遺伝子制御機構として重要な役割を果たしている。この機構を光で制御する試みとして、DNAとRNAはバックボーンの光分解性基で修飾されてきた（「統計的バックボーンケージング」と呼ばれる手法で、保護基は主にバックボーンのリン酸基と反応する）。生物内では、修飾された核酸は「サイレント」であり、光照射によってのみその活性がオンになる。^{[6]この手法は、遺伝子活性の時系列が特に興味深い}発生生物学で使用されている。ケージド核酸により、研究者は生物全体の発生中に関心のある遺伝子を非常に正確にオンにすることができる。^[7]

小分子は化学合成によって簡単に改変できるため、生物学研究で最初に改変され使用された分子の 1 つです。ケージド小分子にはさまざまな種類があります。

光化学反応は非発光性の反応物を蛍光物質に変換することができる。^{[8]これらの反応は}超解像顕微鏡で利用され、回折限界を超えた局在化を可能にする。

光でエフェクターを活性化することの利点（正確な制御、素早い反応、高い特異性、交差反応がない）は、神経伝達物質において特に興味深い。ケージドドーパミン、セロトニン、グリシン、GABAが合成されており、神経活動に対するそれらの効果は広範囲に研究されている。^[9]

アミノ酸だけでなくイオンもケージ化できます。カルシウムは強力な細胞内セカンドメッセンジャーであるため、 EDTAのイオン捕捉特性を利用してケージ化バリアントが合成されています。EDTA骨格の光誘導切断により、細胞内に遊離カルシウムの波が発生します。^[10]

細胞内でシグナルを伝達するために使用される分子の別のクラスはホルモンです。エストラジオールのケージド誘導体は、アンケージング時に遺伝子発現を誘導することが示されました。他のケージドホルモンは、受容体-リガンド相互作用の研究に使用されました。 ^[11]

脂質はシグナル伝達に関与していることが示されています。脂質が特定の経路で果たす役割を解明するには、シグナル伝達脂質の濃度を非常に迅速に高められることが有利です。そのため、多くのシグナル伝達脂質も光除去可能な保護基で保護されており、細胞シグナル伝達への影響が研究されています。ケージドPI3Pはエンドソーム融合を誘導することが示されています。^[12]ケージドIP3はIP3の活動電位への影響を解明するのに役立ちました。 ^[13 ]また、ケージドジアシルグリセロールはPKC依存性シグナル伝達に対する脂肪酸鎖長の影響を決定するために使用されています。^[14]

タンパク質-脂質相互作用を研究する場合、別の種類の光活性化が多くの洞察をもたらすことが証明されています。ジアジリジンやベンゾフェノンなどの光不安定基は、紫外線照射により反応性の高いカルベニウムイオンを残し、対象の脂質を相互作用するタンパク質に架橋するために使用できます。この方法論は、既存のタンパク質-脂質相互作用を検証し、新しい相互作用を発見するのに特に役立ちます。^[15]

• 蛍光顕微鏡
• 光学顕微鏡
• 光活性化蛍光タンパク質
• 光活性化局在顕微鏡法（PALM）
• 確率的光学再構成顕微鏡法(STORM)
• 超解像顕微鏡