ヌクレオシドホスホラミダイト

ヌクレオシドホスホラミダイトは、天然または合成ヌクレオシドの誘導体である。これらは、比較的短い核酸断片であるオリゴヌクレオチドおよびその類似体を合成する ために使用される。ヌクレオシドホスホラミダイトは、1981年にBeaucageとCaruthersによって初めて導入された。^[1]望ましくない副反応を避けるため、天然または合成ヌクレオシドに存在する反応性の高いヒドロキシ基および環外アミノ基は適切に保護されている。ヌクレオシド類似体が少なくとも1つのヒドロキシ基を含む限り、適切な保護戦略を使用することで、それをそれぞれのホスホラミダイトに変換し、後者を合成核酸に組み込むことができる。ホスホラミダイト戦略を使用してオリゴヌクレオチド鎖の途中に組み込むには、ヌクレオシド類似体は2つのヒドロキシ基、またはそれほど多くはないが、ヒドロキシ基と別の求核基（アミノまたはメルカプト）を持っている必要がある。例としては、代替ヌクレオチド、LNA、モルホリノ、2'位で修飾されたヌクレオシド（OMe、保護されたNH ₂、F）、非標準塩基を含むヌクレオシド（天然ヌクレオシドのイノシンとキサントシンにそれぞれ含まれるヒポキサンチンとキサンチン、Gクランプなどの三環式塩基、^[2]など）、または蛍光基またはリンカーアームで誘導体化された塩基 が含まれますが、これらに限定されません。

ヌクレオシドホスホラミダイトの製造には主に 3 つの方法があります。

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  一般的な方法は、弱酸の触媒作用下で、単一の遊離ヒドロキシ基を有する保護されたヌクレオシドをホスホロジアミダイトで処理することです。^{[3] [4]}いくつかのビスアミダイトは熱的に不安定な化合物であると報告されていますが、^[5]市販のヌクレオシドホスホロアミダイトを調製するために使用されるアミダイトである2-シアノエチルN,N,N',N'-テトライソプロピルホスホロジアミダイトは比較的安定しています。これは、2段階のワンポット手順を使用して合成し、真空 蒸留によって精製することができます。^[6]優れたレビューでは、後者の試薬をヌクレオシドおよび非ヌクレオシドホスホロアミダイトを調製する際に使用する方法について詳細に説明しています。^[7]

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  2番目の方法では、保護されたヌクレオシドを有機塩基、最も一般的にはN-エチル-N,N-ジイソプロピルアミン（ヒューニッヒ塩基）の存在下でホスホロクロリダイトで処理する。^[8]

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  3番目の方法^[9]では、保護されたヌクレオシドをまず有機塩基、最も一般的にはN-エチル-N,N-ジイソプロピルアミン（ヒューニッヒ塩基）の存在下でクロロN,N,N',N'-テトライソプロピルホスホロジアミダイトで処理して保護されたヌクレオシドジアミダイトを形成する。後者は弱酸の存在下で、所望のホスファイト保護基に対応するアルコール、例えば2-シアノエタノールで処理される。

ヌクレオシドホスホラミダイトは、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製されます。ホスホラミダイト部分の安定性を保証するには、3～5% のトリエチルアミンを含む溶出液でカラムを平衡化し、分離の全過程を通じて溶出液中のこの濃度を維持することが推奨されます。ホスホラミダイトの純度は、³¹ P NMR 分光法で評価できます。ヌクレオシドホスホラミダイトの P(III) 原子はキラルであるため、化合物の 2 つのジアステレオマーに対応して、約 149 ppm に 2 つのピークを示します。存在する可能性のある亜リン酸トリエステル不純物は、138～140 ppm にピークを示します。H-ホスホネート不純物は、8 ppm と 10 ppm にピークを示します。

ヌクレオシドホスホラミダイトは比較的安定した化合物で、4 °C 未満の温度で空気のない無水条件で粉末として保存すると、保存期間が長くなります。アミダイトは穏やかな塩基性条件に耐えます。対照的に、弱い酸が存在すると、ホスホラミダイトはほぼ瞬時に分解します。ホスホラミダイトは中性条件下では加水分解に対して比較的安定しています。たとえば、 25 °C の 95% 水性アセトニトリル中の2-シアノエチル 5'- O -(4,4'-ジメトキシトリチル)チミジン-3'- O -(N,N-ジイソプロピルアミノ) ホスファイトの半減期は200 時間です。^[10]

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  ホスホラミダイトの最も重要な特徴は、ホスホラミダイトカップリング反応を起こす能力、すなわち、酸性アゾール触媒、1 H -テトラゾール、2-エチルチオテトラゾール、[11] 2-ベンジルチオテトラゾール、[12] [13] 4,5-ジシアノイミダゾール、[14] または多くの類似化合物の存在下で求核基と反応する能力である。反応は極めて急速^に進行^する。この特徴により^、ヌクレオシドホスホラミダイトはオリゴヌクレオチド合成における有用な中間体となる。立体化学的には、ホスホラミダイトカップリングは、P(III)キラル中心でのエピマー化（ジアステレオマーの形成）をもたらす。

水が求核剤として作用する場合、生成物は上の図に示すように H-ホスホネートジエステルです。溶媒と試薬に残留水が存在するため、後者の化合物の形成は、特にオリゴヌクレオチド合成において、ホスホラミダイトを調製する際に最もよく見られる問題です。

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  ホスホロアミダイトは、弱塩基存在下でのヨウ素水溶液や過酸化水素^[15]などの弱い酸化剤によって容易に酸化され、それぞれのホスホロアミデートを形成する。

同様に、ホスホラミダイトは他のカルコゲンと反応する。硫黄^{[15] [16]}溶液または総称して硫化剤と呼ばれるいくつかの化合物^{[17] [18]}と接触させると、ホスホラミダイトは定量的にホスホロチオアミデートを形成する。セレン^{[15] [16]}またはセレン誘導体^[19]との反応では、ホスホロセレノアミデートが生成される。このタイプのすべての反応において、リン原子の配置は保持される。

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  ヌクレオシドホスホラミダイトはミカエリス・アルブゾフ反応を受けて、それぞれのホスホナミデートを形成する。1つの例として、アクリロニトリルの存在下でのホスホナミデートの調製が挙げられる。^[20]報告によると、室温では、反応は立体選択的であり、リン中心の配置が保持される。対照的に、55℃で反応を行うと、ラセミ化生成物が生じる。

• ホスフィンや第三級ホスフィットと同様に、ホスホラミダイトは容易にシュタウディンガー反応を起こします。

(RO) ₂ P-N(R ¹ ) ₂ + R ² -N ₃ + H ₂ O ---- (RO) ₂ P(=O)-N(R ¹ ) ₂ + R ² -NH ₂ + N ₂ ;

天然ヌクレオチド（ヌクレオシド-3'-または5'-リン酸）およびそのホスホジエステル類似体は、高収率でオリゴヌクレオチドを迅速に合成するには反応性が不十分です。ホスファイトトリエステル法の構成要素として機能するヌクレオシドの3'- ​​O -（N、N -ジイソプロピルホスホラミダイト）誘導体（ヌクレオシドホスホラミダイト）を使用することで、ヌクレオシド間結合の選択性と形成速度が劇的に改善されます。望ましくない副反応を防ぐには、保護基を結合してヌクレオシドに存在する他のすべての官能基を非反応性（保護）にする必要があります。オリゴヌクレオチド鎖の組み立てが完了すると、すべての保護基が除去され、目的のオリゴヌクレオチドが生成されます。以下では、現在市販されている^{[21] [22] [23] [24] [25]}および最も一般的なヌクレオシドホスホラミダイトビルディングブロックに使用されている保護基について簡単にレビューします。

• 5'-ヒドロキシル基は酸に不安定なDMT (4,4'-ジメトキシトリチル) 基によって保護されています。
• チミジンとウリジンの核酸塩基であるチミンとウラシルは、それぞれ環外アミノ基を持たないため、保護を必要としない。対照的に、核酸塩基のアデニン、シトシン、グアニンは環外アミノ基を持ち、カップリング反応の条件下で活性化ホスホラミダイトと反応す​​る。合成サイクルの追加ステップを犠牲にして、保護されていないアミノ基を持つホスホラミダイトを使用してオリゴヌクレオチド鎖アセンブリを実行することもできるが、^[26]ほとんどの場合、これらはオリゴヌクレオチド鎖アセンブリの全長にわたって永久に保護されたままになります。環外アミノ基の保護は、5'-ヒドロキシ基の保護と直交している必要があります。これは、5'-ヒドロキシ基が各合成サイクルの最後に除去されるためです。実装が最も簡単で、したがって最も広く受け入れられているのは、環外アミノ基が塩基不安定な保護を持つ戦略です。ほとんどの場合、2つの保護スキームが使用されます。
• 最初の標準的でより堅牢なスキーム（図）では、A、dA、C、dC、GにBz （ベンゾイル）保護が使用され、dGはイソブチリル基で保護されています。最近では、図に示すように、CとdCを保護するためにAc（アセチル）基がよく使用されています。^[27]
• 2番目の穏やかな保護スキームでは、AとdAはイソブチリル^[28]またはフェノキシアセチル基（PAC）^[29]で保護されています。CとdCはアセチル保護を受けており^[27]、GとdGは4-イソプロピルフェノキシアセチル（i-Pr-PAC）^[30]またはジメチルホルムアミジノ（dmf）^[31]基で保護されています。穏やかな保護基は、標準的な保護基よりも簡単に除去できます。ただし、これらの基を持つホスホラミダイトは、溶液中で保存すると安定性が低くなります。
• ホスファイト基は塩基不安定な2-シアノエチル基によって保護されている。^[32]ホスホラミダイトが固体支持体に結合したオリゴヌクレオチドにカップリングされ、ホスファイト部分がP(V)種に変換されると、リン酸保護の存在は、さらなるカップリング反応を成功させるために必須ではない。^[33]

• RNA合成において、2'-ヒドロキシ基はTBDMS（t-ブチルジメチルシリル）基で保護されている。^{[34] [35] [36] [37]}またはTOM（トリイソプロピルシリルオキシメチル）基で保護されており、^{[38] [39]}どちらもフッ化物イオン処理によって除去可能である。
• ホスファイト部分は、酸性条件下で反応するジイソプロピルアミノ（i Pr ₂ N）基も有しています。活性化すると、ジイソプロピルアミノ基が脱離し、支持体に結合したオリゴヌクレオチドの 5'-ヒドロキシ基によって置換されます。

• DNA合成
• 核酸類似体
• オリゴヌクレオチド合成

• 包括的天然物化学、第 7 巻: DNA と分子生物学の側面。クール、エリック T.; 編集者。ネス。(1999)、733 ページ。出版社: (エルゼビア、アムステルダム、ネス。)
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• Beaucage SL、 Iyer RP (1993) 。 「ホスホラミダイト法による修飾オリゴヌクレオチドの合成とその応用」。Tetrahedron。49 (28): 6123–6194。doi : 10.1016/s0040-4020(01)87958-8。
• Beaucage, S L. 「オリゴデオキシリボヌクレオチドの合成。ホスホラミダイト法。分子生物学の方法（トトワ、ニュージャージー州、米国）（1993）、20（オリゴヌクレオチドおよび類似体のプロトコル）、33–61。
• Reese CB (2002). 「オリゴヌクレオチドとポリヌクレオチドの化学合成：個人的な解説」Tetrahedron . 58 (44): 8893–8920. doi :10.1016/s0040-4020(02)01084-0.
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