ノックアウトラット

ノックアウトラットは、標的 を絞った突然変異（遺伝子トラッピング）によって単一の遺伝子がオフにされた遺伝子操作されたラットであり、学術研究や製薬研究に使用されます。ノックアウトラットは人間の病気を模倣することができ、遺伝子機能の研究（機能ゲノミクス）や新薬の発見と開発のための重要なツールです。ノックアウトラットの生産は、2008年まで経済的にも技術的にも実現可能ではありませんでした。^{[1] [2] [3] [4]}

国立衛生研究所（NIH）からの資金援助と、ノックアウトラットコンソーシアム（KORC）は、ノックアウトラットを作成するための費用対効果の高い方法を生み出しました。ラットを人間の健康研究のためのより多目的なツールとして開発することの重要性は、NIHがノックアウトラットコンソーシアムを通じて行った1億2000万ドルの投資によって証明されています。ラットゲノム配列決定プロジェクトコンソーシアムにより、ドブネズミ（ Rattus norvegicus）の実験室系統のドラフト配列が発表さ^{れました。 [5] 2009年には、}ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術のさらなる開発により、標的を定めた生殖細胞伝達変異を持つ初のノックアウトラットが誕生しました。 ^{[6]ジンクフィンガーヌクレアーゼ技術を使用した}パーキンソン病、アルツハイマー病、高血圧、糖尿病 のノックアウトラット疾患モデルは、SAGE Labsによって商品化されています。 ^{[7] [8]}

マウス、ラット、ヒトは、お互いの遺伝子の約1％を除いてすべてを共有しているため^{[5] [9] [10]、}げっ歯類はヒトの遺伝子機能の研究に適したモデル生物です。マウスとラットはどちらも比較的小型で、扱いやすく、世代時間が短く、遺伝的に近親交配されています。マウスは有用なげっ歯類モデルであることが証明されており、マウスの遺伝子を日常的に破壊する技術が開発されていますが、多くの場合、ラットはヒトの疾患の研究とモデル化のための優れた実験動物と考えられています。

ラットはマウスよりも生理学的に人間に似ています。たとえば、ラットの心拍数は人間に近いのに対し、マウスの心拍数は5～10倍速いです。人間の心血管疾患、糖尿病、関節炎、および多くの自己免疫疾患、神経疾患、行動疾患、依存症のモデルとしては、マウスよりもラットの方が優れていると広く考えられています。^[11]さらに、ラットモデルは、潜在的な治療化合物の薬力学と毒性をテストするのにマウスモデルよりも優れています。これは、ラットの解毒酵素の数と種類の多くが人間のものと非常に似ているためです。^[12]ラットは体が大きいため、機器による研究に適しており、採血、神経伝導、手術などの操作も容易です。

マウスでは遺伝子操作の技術が利用可能であり、ヒト疾患のモデル化によく使用されています。マウス遺伝子の約60% ^[13]について公開されたノックアウトが存在しますが、一般的なヒト疾患の大部分にはノックアウトマウスモデルがありません。ノックアウトラットモデルはマウスの代替であり、マウスでは利用できない新しい遺伝子破壊を作成できる可能性があります。ノックアウトラットモデルは、既存のトランスジェニックマウスモデルを補完することもできます。マウスとラットの変異体を比較すると、げっ歯類特有の表現型と一般的な哺乳類の 表現型を区別しやすくなります。

ラットモデルは、心血管疾患、精神疾患（行動介入および依存症の研究）、神経再生、糖尿病、移植、自己免疫疾患（関節リウマチ）、癌、および創傷および骨の治癒を含む多くの医学研究分野の進歩に使用されてきた。ラットゲノム配列の完成は非常に重要な情報を提供するが、これらの疾患が遺伝子機能とどのように関連しているかを知るには、特定のゲノム配列を操作するノックアウトラットモデルを作成する効率的な方法が必要である。遺伝子操作のほとんどの技術、例えば遺伝子トラップによるランダム突然変異誘発（レトロウイルスベースおよび非レトロウイルスベース）、遺伝子ノックアウト/ノックイン、および条件付き突然変異は、胚性幹（ES）細胞の培養と操作に依存している。^[14]ラットES細胞はつい最近単離されたばかりで、その遺伝子改変の実証は報告されていない。その結果、マウスで広く使用されている多くの遺伝子操作技術は、ラットでは不可能である。

2007 年のモバイルDNA技術と 2009 年のジンクフィンガーヌクレアーゼ技術の商業開発までは、ヒト疾患のラットモデルの作成に使用できる技術は、クローニングと N-エチル-N-ニトロソ尿素 ( ENU ) を使用した化学的突然変異誘発の 2 つしかありませんでした。体細胞核移植(SCNT)によるクローニングは、体細胞を変異させ、これらの細胞を SCNT に使用することで、理論的には特定の突然変異を持つラットを作成するために使用できますが、このアプローチはノックアウトラットの作成にうまく使用されていません。この戦略の問題の 1 つは、SCNT が極めて非効率的であることです。最初に発表された試みの成功率は 1% 未満でした。^[15]また、ENU 突然変異誘発は、マウスで一般的なランダム突然変異誘発遺伝子ノックアウト戦略であり、ラットでも使用できます。ENU 突然変異誘発では、化学物質 N-エチル-N-ニトロソ尿素 (ENU) を使用して、ゲノムに 1 塩基の変化を作成します。 ENU は、そのエチル基を DNA の酸素または窒素ラジカルに転移させ、誤対合および塩基対置換を引き起こします。突然変異動物は、雄マウスに ENU を注射し、野生型の雌と交配させて突然変異の子孫を産出することで作成できます。ENU の突然変異誘発により、ランダムな突然変異が高頻度に発生し、配偶子 200～700 個につき、任意の遺伝子で約 1 つの塩基対の変化が起こります。^[16]高い突然変異誘発性にもかかわらず、ENU の物理的浸透は限られており、雄 1 匹あたり約 500 個の遺伝子のみが突然変異し、観察可能な表現型を持つ突然変異は全体のごくわずかです。通常、1 つの新しい表現型を生成するには、1 匹の動物で何千もの突然変異を作成する必要があります。

ENU技術の最近の改善にもかかわらず、^{[17] [18] [19]}特定の表現型の原因となる突然変異のマッピングは、通常、困難で時間がかかります。中立的な突然変異は、広範囲にわたる繁殖によって原因となる突然変異から分離する必要があります。ENUおよびクローニング方法は、ラットの遺伝子ノックアウトを作成してマッピングし、人間の病気の新しいモデルを作成するには、単純に非効率的です。2007年までに、ウィスコンシン医科大学が実行したこれまでで最大のラットENU突然変異誘発プロジェクトでは、ノックアウトラインあたり平均20万ドルのコストで、5年間でわずか9つのノックアウトラットラインを生成することができました。一部の企業はまだこの戦略を追求していますが、ウィスコンシン医科大学は、モバイルDNAとCompoZr ZFNテクノロジーを使用した、より効率的で商業的に実行可能な方法に切り替えました。

ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）と転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）は、ユーザーが指定した場所でDNAに二重鎖切断を作成することにより、ゲノムの標的編集を容易にする設計されたDNA結合タンパク質です。二重鎖切断は、細胞の自然なDNA修復プロセス、すなわち相同組換えと非相同末端結合を刺激するという点で、部位特異的変異誘発に重要です。細胞が非相同末端結合経路を使用して二重鎖切断を修復する場合、修復の固有の不正確さにより、正確に標的を絞った変異が頻繁に生成されます。その結果、標的遺伝子がノックアウトされた胚が生成されます。^{[6] [20]}標準的なマイクロインジェクション技術により、この技術では4〜6か月でノックアウトラットを作成できます。モバイルDNAを使用する場合と比較したZFNおよびTALENを介した遺伝子ノックアウトの主な利点は、特定の遺伝子をノックアウトの対象としてユニークかつ特異的に選択できることです。対照的に、モバイル DNA 技術を使用して作成されたノックアウトはランダムであるため、目的の遺伝子をターゲットにする可能性は低くなります。

モバイル DNA (ジャンピング ジーン) 技術では、レトロトランスポゾンとトランスポゾンを使用してノックアウト ラット モデルを作成します。このプラットフォーム技術は、ラットを含む哺乳類モデル生物の生殖細胞(精子と卵母細胞) で直接ランダム突然変異を誘発できるため、哺乳類における遺伝子ノックアウト アプローチを成功させるためのすべての基準を満たしています。この技術を使用すると、遺伝子は完全にかつ安定した方法で破壊され、高頻度でノックアウトされ、ゲノム全体にわたってランダムに破壊されます。突然変異のゲノム位置は簡単にマッピングできるため、後で使用するためのノックアウト ラットのライブラリを作成できます。ランダム ノックアウト突然変異が作成されると、ノックアウト ラインと組織特異的にCRE リコンビナーゼを発現するラット ラインを交配することで、条件付き突然変異などのより洗練された突然変異を作成できます。ノックインは、組み換えを介したカセット交換によって作成できます。

piggyBac (PB) DNA トランスポゾンは、「カット アンド ペースト」メカニズムを介して移動します。このメカニズムでは、トランスポゾン自体によってコード化されたトランスポザーゼ酵素 (PB トランスポザーゼ) が、トランスポゾンをゲノム内の他の部位で切除して再統合します。PB トランスポザーゼは、トランスポゾンの両側にある PB 逆末端反復 (ITR) を特に認識し、これらの配列に結合してトランスポゾンの切除を触媒します。次に、PB はゲノム全体の TTAA 部位^[21]に比較的ランダムな方法で統合されます。遺伝子トラップ変異を作成する場合 (またはトランスジェニック動物を生成するために適合させる場合)、トランスポザーゼは 1 つのプラスミド上でトランスに供給され、トランスポザーゼの結合部位 (ITR) に両側にある遺伝子トラップを含む組み換えトランスポゾンであるドナー トランスポゾンを含むプラスミドと共トランスフェクトされます。トランスポザーゼは、プラスミドからのトランスポゾンの切除とそれに続くゲノムへの組み込みを触媒する。コーディング領域への組み込みは、遺伝子トラップ発現に必要な要素を捕捉する。PB はいくつかの理想的な特性を有する: (1) 遺伝子内に優先的に挿入する (挿入の 50 ～ 67% が遺伝子にヒットする) (2) 局所ホッピングを示さない (ゲノムを広範囲にカバーする) (3) トランスポザーゼのレベルが上昇すると転位が減少する過剰産生阻害の影響を受けない 4) スリーピング ビューティーとは異なり、ドナー サイトからきれいに切除され、「フットプリント」を残さない。 ^{[22] [23]}

スリーピングビューティー（SB）トランスポゾンは、脊椎動物と無脊椎動物の両方のゲノムに広く分布する DNA トランスポゾンの Tc1/mariner スーパーファミリーの派生種です。しかし、このファミリーの内因性 DNA トランスポゾンは、脊椎動物ゲノムでは完全に不活性です。サケ科の要素のサブファミリーの不活性トランスポゾンの配列から合成された活性 Tc1/mariner トランスポゾンが「目覚め」、スリーピングビューティーと名付けられたトランスポゾンを形成しました。^[24] SB は、他の DNA トランスポゾンと同様に、カットアンドペースト機構を介して自身を移動させます。この機構では、トランスポゾン自体によってコードされているトランスポザーゼ酵素が、ゲノム内の他の部位でトランスポゾンを切除して再統合します。340 アミノ酸の SB タンパク質は、トランスポゾンの両側にある逆方向末端反復配列（ITR）を認識し、これらの配列に結合してトランスポゾンの切除を触媒します。その後、SBはゲノム内のランダムな部位に組み込まれるが、いくつかの研究では転写単位に対するわずかな優先性が報告されている。^{[25] [26]}また、すべてのTc1/marinerトランスポゾンと同様に、標的部位にTAジヌクレオチドが単純に必要となる。^[27]

SBトランスポゾンは、多くの脊椎動物種における挿入変異誘発の強力なツールです。最近では、マウスとラットの両方で生殖細胞系列の変異誘発に特に有用であることが示されました。^{[28] [29] [30] [31] [32] [33] [34]} SBが遺伝子発見に向けた非常に魅力的な変異誘発物質となっているのには、いくつかの利点があります。1)特定のゲノム領域内または特定の認識配列内での挿入に対する偏りがほとんどない、2)トランスポゾンの新規挿入により、「タグ付き」配列マーカーが提供され、単純なPCRクローニング法で特定の変異を迅速に識別できる、3)in vivoでのSB挿入変異誘発により、単一の動物、および腺腫性ポリープなどの単一の組織で複数の変異を迅速かつ容易に生成できます。

トランスポゾンとレトロトランスポゾンは、遺伝子破壊に使用される可動性の DNA 片として、偏りのない遺伝子発見のための貴重なツールです。LINE (long interspersed nuclear elements) などのレトロトランスポゾンは、「コピー アンド ペースト」メカニズムを介して移動し、多くの真核生物種に豊富に存在します。いくつかの L1 レトロトランスポゾンは、マウスとヒトで活性を保っています。L1 には、発現を促進する 5' 非翻訳領域内の小さな内部プロモーター、2 つのオープン リーディング フレーム(ORF)、およびポリアデニル化の配列を含む 3' 非翻訳領域が含まれます。2 つの ORF は、自律的なレトロトランスポジションに必要なタンパク質をコードします。ORF1 はRNA結合タンパク質をコードし、ORF2 は、DNA の部位を切り込み、RT を介してコピーを生成するエンドヌクレアーゼ (EN) および逆転写酵素 (RT) 活性を含むタンパク質をコードします。これらのタンパク質は、それらをコードする転写産物に結合して作用する圧倒的な特異性を示し、親 L1 RNA のほぼ排他的移動を可能にします。 ORF2タンパク質のRT活性を利用して、転写されたL1 RNAはターゲットプライム逆転写（TPRT）と呼ばれるプロセスによってDNAにコピーされ、^[35]ゲノムに組み込まれます。統合は特定のゲノム領域に対してほとんど偏りなく行われ、単純なコンセンサス配列5'TTTT'A-3'（この配列の小さなバリエーションを含む）が必要です。統合されたL1配列は5'末端で切り捨てられることが多く、平均合計サイズは1 Kbで、多くは3'末端配列のみを含みます。

レトロトランスポジションの性質により、L1にはいくつかのユニークな利点があります。L1レトロトランスポゾンは、挿入変異原がプロモーターから継続的に転写されるため、本質的に無制限に供給され、単一の細胞で多数の変異が必要な場合に便利です。L1要素はまた、挿入の分布がほぼランダムで、ゲノムの広範囲に及んでいます。^{[36] [37] [38]}ゲノム部位でのL1挿入も不可逆的であるため、L1挿入によって引き起こされる突然変異イベントは、L1配列によって「タグ付け」されます。

• バイオブリーディングラット
• 遺伝学
• 遺伝子ノックアウト
• 実験動物
• 遺伝子組み換え動物

• NIH ラットゲノムと遺伝学
• 科学者がラットのゲノムをヒトやマウスと比較
• ノックアウトラットコンソーシアム（KORC）のウェブサイト
• 国立衛生研究所のウェブサイト
• トランスポサジェン：ノックアウトラットモデルの生産者
• ノックアウトラット - Horizo​​n Discovery (旧 SAGE Labs)