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ENU（N-エチル-N-ニトロソ尿素、化学式C₃H₇N₃O₂ ）は、非常に強力な突然変異誘発物質である。マウスの特定の遺伝子において、ENUは700箇所に1箇所の割合で新たな突然変異を誘発する。また、高用量では毒性を示す。
この化学物質はアルキル化剤であり、ENUのエチル基を核酸中の核酸塩基（通常はチミン）に転移させることで作用する。主な標的は、成熟精子の由来となる精原幹細胞である。
ビル・ラッセル（1951年）は、放射線や化学物質などの変異原をテストするための遺伝子スクリーニングで使用される、特別に設計されたマウス系統であるT（テスト）系統を作成することで、マウス遺伝学の分野で画期的な業績を残しました。[ 3 ] T系統のマウスは、容易に識別できる形質に影響を与える7つの劣性で生存可能な突然変異を保有しています。オークリッジ国立研究所で、ラッセルの当初の目標は、放射線によって誘発される生殖細胞系列の遺伝可能な遺伝子突然変異率を決定することでした。そのため、彼は一連の遺伝子座が放射線によってどのくらいの頻度で突然変異するかを定義するために、T系統のマウスを使用することに決めました。T系統のマウスの突然変異は劣性であるため、子孫は野生型の表現型になります（突然変異体[例： s / s突然変異体オス]と野生型メス[ + / + ]を交配した結果）。したがって、放射線によって7つの遺伝子座のいずれかに突然変異が生じた子孫は、第一世代で突然変異表現型を示すことになる。この方法、特定遺伝子座テスト（SLT）により、ラッセルは広範囲の特定の突然変異を研究し、放射線によって誘発される突然変異率を計算することができた。[ 4 ]
SLTに対する放射線の影響を研究することに加えて、RussellらはSLTに対するプロカルバジンやエチルニトロソ尿素などの化学変異原の影響を研究することにも関心を持っていた。当時、プロカルバジンはSLTにおいて顕著な精原細胞の突然変異を引き起こすことが知られている最も強力な化学変異原であったが、その発生率はX線による突然変異の3分の1であった。Russellらは以前、ジエチルニトロソアミン（DEN）を用いてショウジョウバエで突然変異誘発研究を行っており、それがきっかけでSLTにDENを使用することになった。しかし、DENは突然変異誘発性を発揮するためには酵素的にアルキル化剤に変換される必要があり、おそらく哺乳類ではこの酵素的活性化が不十分であったと考えられる。これは、DENによってマウスに生じる極めて低い突然変異率（60,179匹の子孫のうち3匹）によって説明できる。この問題を克服するために、代謝を必要としないアルキル化剤である新しい変異原、N-エチルN-ニトロソ尿素（ENU）の使用が、Ekkehart VegelからRussellらに提案された。ENU（250 mg/kg）を投与したマウスは10週間不妊期間を経た。回復後、90匹の雄をT系統の雌と交配し、7584匹の仔が得られた。[ 4 ]彼らの結果は、250 mg/kgのENU投与量で、600R（1R = 2.6 x10^-4クーロン/kg）の急性X線照射で得られた突然変異率の5倍の突然変異率を生み出すことができることを示した。この突然変異率は、プロカルバジン（600 mg/kg）で得られた突然変異率の15倍でもあった。 [ 5 ]
不妊の初期期間の問題を克服するために、ラッセルグループは、ENUを一度に大量に注射する代わりに、分割投与（100 mg/kg）[ 6 ]を週ごとのスケジュールで投与することで、総投与量（300～400 mg/kg）[ 6 ]を許容できることを示した。これにより、突然変異頻度がX線照射の12倍、プロカルバジンの36倍、自然突然変異の200倍以上に改善されたことも示された。突然変異率を7つの遺伝子座すべてで平均すると、ENUは700個の配偶子ごとに1つの遺伝子座で突然変異を誘発することがわかった。[ 4 ]
ラッセルらがENUを最も強力な変異原として発見して以来、ENUは順方向（表現型に基づく）遺伝子スクリーニングに用いられ、関心のある表現型を特定して研究することができる。図1に示すように、スクリーニングプロセスは雄マウスにENUを投与して変異誘発することから始まる。続いて、子孫の系統的な表現型解析が行われる。子孫は行動、生理、または形態異常の変化について評価される。異常な表現型が特定される。次に、関心のある表現型を持つ変異マウスの位置クローニングによって候補遺伝子が特定される。
ENUは、研究者の関心に合ったさまざまな遺伝子スクリーニングを設計することで、遺伝子ツールとして使用されます。評価される領域に応じて、順方向遺伝子スクリーニングは図2に示すように分類できます。[ 9 ]
地域固有の分類は、以下のように行うことができます。
相補性とは、異なる遺伝子に劣性突然変異を持つ生物を交配させたときに野生型表現型が生成される現象である。[ 9 ]したがって、生物が機能的な遺伝子のコピーを1つ持っている場合、この機能的なコピーは、突然変異または失われた遺伝子のコピーを相補することができる。対照的に、遺伝子の両方のコピーが突然変異または失われている場合、対立遺伝子の非相補性（図3）が生じ、表現型が発現する。
冗長性の現象は、多くの場合、複数の遺伝子が特定の遺伝子の喪失を補うことができることを説明する。しかし、同じ生物学的プロセスまたは経路に関与する2つ以上の遺伝子が失われると、非対立遺伝子非相補性につながる。非相補性スクリーニングでは、ENU誘導雄を、目的遺伝子(A)の変異対立遺伝子( a )を持つ雌と交配する。変異が優性であれば、すべての世代に存在する。しかし、変異が劣性である場合、またはG 1の子孫が生存できない場合は、変異を特定するために別の戦略が使用される。ENU処理雄を野生型雌と交配する。G 1個体のプールから、ヘテロ接合体の雄を、変異対立遺伝子( a )を持つ雌と交配する。G 2の子孫が不妊または生存できない場合は、G 1雄から再び回収することができる。
染色体上の欠失は、自然発生的に起こる場合と誘発される場合がある。このスクリーニングでは、ENU処理した雄を、目的領域の欠失に関してホモ接合体である雌と交配させる。G1世代の子孫は、ENU誘発変異に関して複合ヘテロ接合体である（図4）。また、欠失領域の遺伝子に関して半数体であるため、ENU誘発変異による機能喪失または機能獲得は優性的に発現する。このように、欠失スクリーニングは、G1世代の子孫自体で変異を特定できるため、他の劣性スクリーニングよりも優れている。
Rinchikらは欠失スクリーニングと相補性解析を行い、11個の独立した劣性遺伝子座を単離することに成功し、それらは染色体7上の7つの相補性グループ、すなわちアルビノ（Tyr）遺伝子とピンクアイ希釈（p）遺伝子の周辺領域に分類された。[ 9 ]
バランサー領域を持つ染色体はバランサー染色体と呼ばれます。バランサーとは、減数分裂中に相同染色体間の組換えを防ぐ領域です。これは、逆位領域または一連の逆位の存在によって可能になります。バランサー染色体は、主にショウジョウバエの遺伝学の研究に使用されました。Monica Justiceら(2009) は、Allan Bradleyらがマウス染色体 11 上に構築したバランサー染色体を使用して、効率的にバランサースクリーニングを実施しました。このスクリーニングでは、ENU 誘導雄をバランサー染色体に関してヘテロ接合体の雌と交配します。[ 9 ]バランサー染色体を持つマウスは、耳と尾が黄色です。G 1ヘテロ接合体 (図 5) を、巻き毛をもたらす rex 変異 (図 5 のRex ) を持つ雌と交配します。 G 2では、バランサーのホモ接合体は生存不能であり、回収されません。バランサーまたは ENU 誘発変異に対してトランス位に rex 変異を持つマウスは、巻き毛になり、廃棄されます。ENU 変異体 + rex 変異体のマウスは、次の繁殖ステップ (ホモ接合体変異体の生成) で、これら 2 つの染色体間の組換えを防ぐために廃棄されます。バランサーと ENU 誘発変異の複合ヘテロ接合体であるマウスは、G 3で兄妹交配され、ENU 誘発変異のホモ接合体を得ます。
ゲノムワイドスクリーニングは、複数の遺伝的および生化学的経路が関与する遺伝性疾患の研究に最も有効である。この手法を用いることで、表現型に関連する候補遺伝子またはゲノム領域を特定することができる。
これらのスクリーニングは、単純な優性および劣性表現型を識別するように設計できます（図6）。したがって、ENU誘導G0雄を野生型雌と交配します。G1子孫をスクリーニングして優性突然変異を識別できます。ただし、突然変異が劣性である場合、G1雄から突然変異のホモ接合体であるG3個体を2つの方法で回収できます。
A number of organizations around the world are performing genome-wide mutagenesis screens using ENU. Some of them include the Institute of Experimental Genetics at the German Research Center for Environmental Health (GSF), Munich, Germany; The Jackson Laboratory, Maine, USA; the Australian Phenomics Facility at the Australian National University, Canberra, Australia; the Department of Neurobiology and Physiology at Northwestern University, Illinois, USA; the Oak Ridge National Laboratory, Tennessee, USA; the Medical Research Council (MRC) Harwell, Oxfordshire, United Kingdom; the Department of Genetics at The Scripps Research Institute, California, USA; the Mouse Mutagenesis Center for Developmental Defects at Baylor College of Medicine, Texas, USA; and others.[7]
A modifier such as an enhancer or suppressor can alter the function of a gene. In a modifier screen, an organism with a pre-existing phenotype is selected. Thus, any mutations caused by the mutagen (ENU) can be assessed for their enhancive or suppressive activity.[9] Screening for dominant and recessive mutations is performed in a way similar to the conventional genome-wide screen (Figure 7). A number of modifier screens have been performed on Drosophila. Recently, Aliga et al. performed a dominant modifier screen using ENU-induced mice to identify modifiers of the Notch signaling pathway.[10] Delta 1 is a ligand for the Notch receptor. A homozygous loss-of-function of Delta 1 (Dll1lacZ/lacZ) is embryonically lethal. ENU-treated mice were crossed to Dll1lacZ heterozygotes. 35 mutant lines were generated in G1 of which 7 revealed modifiers of the Notch signaling pathway.
複数の遺伝子が関与する遺伝性疾患の場合、複数の遺伝子の変異が疾患の進行に寄与します。しかし、これらの遺伝子のうちの1つの変異だけでは、表現型に大きく寄与しない可能性があります。このような「素因遺伝子」は、感作スクリーニングを使用して特定できます。[ 11 ]このタイプのスクリーニングでは、遺伝的または環境的背景が改変され、マウスがこれらの変化に敏感になります。素因遺伝子は、改変された遺伝的または環境的背景上で解明できるという考えです。Rinchikらは、糖尿病性腎症に素因のあるマウス変異体の感作スクリーニングを実施しました。マウスは、1型糖尿病の感作背景でENUで処理されました。これらの糖尿病マウスは、インスリン-2遺伝子（Ins2 Akita ）に優性Akita変異を持っていました。これらのマウスは、非糖尿病の子孫では観察されなかった表現型であるアルブミン尿を発症しました。[ 12 ]
一般的に、ENUはかなり不安定であるため、 EMSのような比較的安定性の高い変異原と比較して、実験用変異原として使用する場合に不活性化しやすい。純粋な結晶性ENUは光と湿気に敏感であるため、低温乾燥状態で保管し、必要に応じて溶液に新鮮に調製する必要がある。[ 1 ]水溶液中では、ENUは塩基性pHで急速に分解するため、プロトコルでは、不活性化を補うために周囲光照射の有無にかかわらず、ENU溶液を同量の0.1M KOHで24時間不活性化することが求められている。[ 2 ]