ゲンタマイシン保護アッセイ

ゲンタマイシン保護試験、生存試験、侵入試験は、微生物学で使用される方法であり、病原 細菌が真核細胞に侵入する能力を定量化するために使用されます。

このアッセイは、1970年代に行われたいくつかの観察に基づいており、内部に取り込まれた細菌が抗生物質による殺菌を回避する能力があることが報告されました。^{[1] [2]}このアッセイは、1980年代初頭に 生物学研究で使用され始めました。

細胞内細菌は、複製して感染を拡大するために、宿主細胞（感染した生物の細胞）に侵入する必要があります。赤痢菌（細菌性赤痢の原因）、サルモネラ菌（腸チフス）、マイコバクテリウム菌（ハンセン病および結核）、リステリア菌（リステリア症）など、多くの種が細胞内細菌です。

いくつかの抗生物質は真核細胞を透過できません。したがって、これらの抗生物質は、すでに内部に取り込まれた細胞内細菌を傷つけることはできません。このような抗生物質を使用すると、真核細胞に透過できた細菌と透過できなかった細菌を区別できます。細菌に感染した真核細胞の培養にこのような抗生物質を適用すると、細胞外に残っている細菌は死滅しますが、透過した細菌は死滅しません。このアッセイに選択された抗生物質は、アミノグリコシドの ゲンタマイシンです。

ゲンタマイシン保護試験では、真核細胞としてHeLa細胞がよく使用されますが、他の細胞も使用できます。細菌については、ゲンタマイシンに感受性のある種のみを試験できます。

このアッセイは、研究室で真核細胞を培養するために一般的に使用されているプラ​​スチック製のマイクロタイタープレートで行われます。細胞はウェル内で一晩増殖させ、平らな層を作ります。細菌は別に一晩増殖させます。翌日、真核細胞に細菌を接種し、一緒に 1 時間培養します。プレートを数分間遠心分離すると、細胞と細菌が接触して感染が開始されることがあります。

感染後、ゲンタマイシンをプレートに加え、1時間培養します。抗生物質が細胞に侵入できずに外側に残った細菌をすべて殺します。その後、プレートをよく洗浄して死んだ細菌を除去します。次に、真核細胞を洗剤（最も一般的にはトリトンX-100 ）を使用して溶解します。

細胞に侵入して生き残った細菌は放出され、固形培地プレート上に播種されます。翌日にプレート上に形成されたコロニーを数え、アッセイの開始時に使用された細菌の数を知ることで、研究者は真核細胞に侵入できた細菌の割合を計算することができます。

ゲンタマイシン保護アッセイは、病原体の研究でよく使用されます。この方法を使用すると、特定の遺伝子またはタンパク質が細菌の細胞侵入能力にどの程度寄与しているかを簡単に調べることができます。問題の遺伝子をノックアウトし、細菌の侵入性を通常の野生型細菌と比較することができます。pHレベルや温度などの環境条件も、侵入性への影響を調べるために調べることができます。

ゲンタマイシン保護アッセイは非常に感度が高く、単一の細菌の内部化も検出できます。ただし、いくつかの欠点があります。

• ゲンタマイシンは真核細胞に浸透し、内部に取り込まれた細菌を殺すことがあります。これは、細胞の取り扱いが不十分なために、アッセイ中に細胞の透過性が何らかの形で増加した場合に発生することがあります。
• 細胞内に取り込まれた細菌は、食胞（細胞内の細菌を囲む液胞）に何らかの欠陥がある場合など、外部環境から完全に保護されないことがあります。ゲンタマイシンは、そのような細菌を殺す可能性があります。
• ゲンタマイシンは、細胞の外に残っている細菌をすべて殺すことができない可能性があります。

特定のアッセイの精度を評価するには、陽性コントロールと陰性コントロールを実施する必要があります。上記のようにアッセイを実施する場合、完全に侵襲性であることがわかっている細菌 (陽性コントロール) と非侵襲性であることがわかっている細菌 (陰性コントロール) をアッセイに含める必要があります。

侵入の代替アッセイは、侵入前と侵入後の細菌への抗体の結合に基づく分化免疫染色アッセイです。抗体は蛍光色の光を発し、このアッセイの結果を顕微鏡で観察します。

• 絶対細胞内寄生虫