超解像光揺らぎイメージング

超解像光変動イメージング( SOFI ) は、独立して変動する蛍光発光体の時間的相関に基づいて記録された画像時系列から超解像画像を計算する後処理方法です。

SOFIは、独立して変動する蛍光発光体（有機色素、蛍光タンパク質）で標識された生物学的標本の超解像用に開発されました。単一分子の局在に依存し、回折限界領域（DLA）および時点ごとに1つの活性分子のみを許可するSTORMまたはPALMなどの他の超解像顕微鏡技術と比較して、^{[1] [2] SOFIでは、制御された}光スイッチングおよび/または光活性化、および長いイメージング時間が必要ありません。 ^{[3] [4]}それでも、実際のオン/オフ状態または異なる蛍光強度の状態のいずれかの2つの識別可能な状態を循環する蛍光体が必要です。数学的に言えば、SOFIイメージングは​​、2つの区別可能な方法が存在するキュムラントの計算に依存しています。まず、画像は自己キュムラント^[3]を介して計算できます。自己キュムラントは定義上、各ピクセルの情報のみに依存します。また、改良された方法では、クロスキュムラント^[5]の計算を介してさまざまなピクセルの情報を活用します。キュムラントの計算には限界がありますが、どちらの方法でも最終的な画像の解像度を大幅に向上させることができます。実際、SOFI は 3 次元すべてで解像度を向上させることができます。^[3]

他の超解像法と同様に、SOFI は CCD または CMOS カメラで画像の時系列を記録することに基づいています。他の方法とは対照的に、エミッターの正確な位置特定は必要なく、回折限界領域あたりの活性化蛍光体の量が多くなるため、記録される時系列は大幅に短くなります。n次SOFI 画像のピクセル値は、 n次キュムラントの形式でピクセル時系列の値から計算されますが、ピクセルに割り当てられる最終値は相関関数の積分として考えることができます。最終的に割り当てられたピクセル値の強度は、蛍光信号の明るさと相関の尺度です。数学的には、n次キュムラントはn次相関関数に関連していますが、画像の解像度に関していくつかの利点があります。SOFI では DLA ごとに複数のエミッターが許可されるため、各ピクセルの光子数は、近くのすべての活性化エミッターの信号の重ね合わせから得られます。キュムラント計算により信号がフィルタリングされ、相関の高い変動のみが残ります。これによりコントラストが強化され、バックグラウンドが適切に低減されます。左の図に示されているように、蛍光源の分布は次のようになります。

${\displaystyle \sum _{k=1}^{N}\delta ({\vec {r}}-{\vec {r}}_{k})\cdot \varepsilon _{k}\cdot s_{ k}(t)}$

システムの点像関数（PSF）U（r）と畳み込まれる。したがって、時刻tと位置における蛍光信号は次のように表される。 ${\displaystyle {\vec {r}}}$

${\displaystyle F({\vec {r}},t)=\sum _{k=1}^{N}U({\vec {r}}-{\vec {r}}_{k}) \cdot \varepsilon _{k}\cdot s_{k}(t).}$

上記の式において、N は、時間依存の分子輝度の位置にあるエミッターの量です。ここで、は一定の分子輝度の変数であり、は時間依存の変動関数です。分子輝度は、平均蛍光カウント率を特定領域内の分子数で割ったものです。簡略化のため、サンプルは定常平衡状態にあると仮定する必要があり、したがって蛍光信号はゼロ平均変動として表すことができます。 ${\displaystyle {\vec {r}}_{k}}$${\displaystyle \varepsilon _{k}\cdot s_{k}}$${\displaystyle \varepsilon _{k}}$${\displaystyle s_{k}(t)}$

${\displaystyle \delta F({\vec {r}},t)=F({\vec {r}},t)-\langle F({\vec {r}},t)\rangle _{t}}$

ここで、 は時間平均を表します。ここでの自己相関、例えば 2 次相関は、特定の時間遅れに対して次のように演繹的に記述できます。 ${\displaystyle \langle \cdots \rangle _{t}}$${\displaystyle \tau}$

${\displaystyle \delta F({\vec {r}},t)=\langle \delta F({\vec {r}},t+\tau )\cdot \delta F({\vec {r}}, t)\rangle _{t}}$

これらの式から、光学系の PSF は相関の次数のべき乗で計算する必要があることがわかります。したがって、2 次相関では、PSF はすべての次元に沿って係数 1 だけ減少します。その結果、SOFI 画像の解像度はこの係数に応じて増加します。 ${\displaystyle {\sqrt {2}}}$

ピクセル値の再割り当てに単純な相関関数のみを使用すると、エミッターの時間的変動の独立性が証明され、相互相関項が新しいピクセル値に寄与しなくなります。高次の相関関数の計算では低次の相関の影響を受けますが、低次の相関項はすべて消えるため、キュムラントを計算する方が優れている理由は何でしょうか。

計算上の理由から、高次キュムラントのすべての時間遅れをゼロに設定すると、n次の自己キュムラントの一般的な表現を見つけることができる。^[3]

${\displaystyle AC_{n}({\vec {r}},\tau _{1\ldots n-1}=0)=\sum _{k=1}^{N}U^{n}({\vec {r}}-{\vec {r}}_{k})\varepsilon _{k}^{n}w_{k}(0)}$

${\displaystyle w_{k}}$キュムラントの順序によって影響を受け、主にエミッターの変動特性に依存する特定の相関ベースの重み付け関数です。

非常に高次のキュムラントを計算して PSF の FWHM を縮小することには基本的な制限はありませんが、最終画像に割り当てられる値の重み付けに応じて実際的な制限があります。分子の輝度が高いエミッターは、高次のピクセルのキュムラント値が大幅に増加するだけでなく、さまざまなエミッターの変動の多様な外観からもこのパフォーマンスが期待できます。したがって、結果として得られる画像の強度範囲が広くなることが期待され、その結果、高次の画像では暗いエミッターが明るいエミッターに隠される可能性があります。^{[3] [5]}自己キュムラントの計算は、数学的に非常に魅力的な方法で実現できます。n次のキュムラントは、モーメントからの基本的な再帰で計算できます^[6]

${\displaystyle K_{n}({\vec {r}})=\mu _{n}({\vec {r}})-\sum _{i=1}^{n-1}{\begin {pmatrix}n-1\\i\end{pmatrix}}K_{ni}({\vec {r}})\mu _{i}({\vec {r}})}$

ここで、K はインデックスの順序のキュムラントで、同様にモーメントを表します。括弧内の項は二項係数を示します。この計算方法は、標準の式でキュムラントを計算する場合に比べて簡単です。この方法では、計算にほとんど時間をかけずにキュムラントを計算でき、適切に実装されているため、大きな画像での高次キュムラントの計算にも適しています。 ${\displaystyle \mu}$

より高度なアプローチでは、クロスキュムラントは複数のピクセルの情報を考慮して計算されます。クロスキュムラントは次のように記述できます。^{[5] [7]}

${\displaystyle CC_{n}({\vec {r}},\tau _{1\ldots n-1}=0)=\prod _{j<l}^{n}U{\Bigg (}{\frac {{\vec {r}}_{j}-{\vec {r}}_{l}}{\sqrt {n}}}{\Bigg )}\cdot \sum _{i=1}^{N}U^{n}{\Bigg (}{\vec {r}}_{i}-{\frac {\sum _{k}^{n}{\vec {r}}_{k}}{n}}{\Bigg )}\varepsilon _{i}^{n}w_{i}(0)}$

j、l、kは寄与ピクセルのインデックスですが、i は現在の位置のインデックスです。他のすべての値とインデックスは前と同じように使用されます。この式を自己キュムラントの式と比較した場合の主な違いは、重み付け係数の出現です。この重み付け係数 (距離係数とも呼ばれる) は PSF の形状をしており、各ピクセルの寄与が距離に沿って PSF の形状で減衰するという意味で、相互相関ピクセルの距離に依存します。原則として、これは、ピクセルが離れているほど距離係数が小さくなることを意味します。相互キュムラント手法を使用すると、有効ピクセル サイズを縮小することで、ラベル付けされた標本に関する真の情報を明らかにする新しい仮想ピクセルを作成できます。これらのピクセルは、単純な補間から生成されるピクセルよりも多くの情報を保持します。 ${\displaystyle U(r_{j}-r_{l}/{\sqrt {n}})}$

さらに、クロスキュムラントアプローチは、前述のように相互相関の「損失」による仮想ピクセルの強度差を利用して、光学システムの PSF を推定するために使用できます。^[5]各仮想ピクセルは、ピクセルの距離係数の逆数で再重み付けすることができ、真のキュムラント値を復元できます。最後に、PSF を使用して、「光学伝達関数」(OTF) を再重み付けすることにより、n次キュムラントのnの解像度依存性を作成できます。 ^[5]このステップは、PSF を使用して、計算コストの少ないデコンボリューションを実行することで置き換えることもできます。

クロスキュムラントの計算には、パーティションの合計を計算する計算式を使用する必要があり、計算コストがはるかに高くなります。これは、もちろん、新しい値を割り当てるために異なるピクセルを組み合わせるためです。したがって、この時点では高速な再帰アプローチは使用できません。クロスキュムラントの計算には、次の式を使用できます。^[8]

${\displaystyle K_{n}{\Bigg (}{\vec {r}}={\frac {1}{n}}\sum _{i=1}^{n}{\vec {r_{i}}}{\Bigg )}=\sum _{P}(-1)^{|P|-1}(|P|-1)!\prod _{p\in P}{\Big \langle }\prod _{i\in p}F({\vec {r}})_{i}{\Big \rangle }_{t}}$

この式で、P は可能なパーティションの数、p は各パーティションの異なる部分を表します。さらに、i は計算中に考慮されるさまざまなピクセル位置のインデックスであり、Fの場合は、さまざまな寄与ピクセルの画像スタックに過ぎません。クロスキュムラント アプローチは、前述のようにキュムラントの順序に応じて仮想ピクセルの生成を容易にします。これらの仮想ピクセルは、下の画像の部分 A に示されているように、4 次クロスキュムラント イメージの元のピクセルから特定のパターンで計算できます。パターン自体は、元のイメージ ピクセル A、B、C、および D のすべての可能な組み合わせを計算することで簡単に生成されます。ここでは、これは「繰り返しによる組み合わせ」のスキームによって行われました。仮想ピクセルは、相関自体が原因で強度が低下します。2 番目の画像の部分 B は、仮想ピクセルのクロス相関に対するこの一般的な依存性を示しています。意味のあるピクセル値を復元するために、画像は仮想ピクセルグリッドの各ピクセルの距離係数をPSF形状で定義し、同じ距離係数に関連するすべての画像ピクセルに逆数を適用するルーチンによって平滑化されます。^{[5] [7]}