蛍光寿命イメージング顕微鏡

蛍光寿命イメージング顕微鏡法（FLIM）は、試料中の蛍光色素から放出される光子の指数関数的減衰率の違いを利用したイメージング技術です。共焦点顕微鏡、二光子励起顕微鏡、多光子トモグラフィーなどのイメージング技術として利用できます。

FLIMでは、蛍光体の強度ではなく蛍光寿命（FLT）を使用して画像を作成します。蛍光寿命は蛍光体の局所的な微小環境に依存するため、光源の明るさの変化、背景光強度、または限定的な光退色による蛍光強度の誤った測定を排除できます。この技術には、厚いサンプル層での光子散乱の影響を最小限に抑えるという利点もあります。微小環境に依存するため、寿命測定はpH ^{[ 1 ]} 、粘度^{[ 2 ]}、および化学種の濃度^{[ 3 ] [ 4 ]}の指標として使用されてきました。

光子によって励起された蛍光体は、いくつかの異なる（放射性および／または非放射性の）崩壊経路による崩壊率に基づいて、一定の確率で基底状態に戻ります。蛍光を観測するには、これらの経路のいずれかが光子の自然放出によるものでなければなりません。アンサンブル記述では、放出された蛍光は時間とともに減衰します。

${\displaystyle I(t)=I_{0}e^{-t/\tau }}$

どこ

${\displaystyle {\frac {1}{\tau }}=\sum k_{i}}$。

上記において、${\displaystyle t}$時間です、${\displaystyle \tau }$は蛍光寿命であり、${\displaystyle I_{0}}$初期蛍光は${\displaystyle t=0}$、 そして${\displaystyle k_{i}}$は各減衰経路の速度であり、そのうち少なくとも1つは蛍光減衰速度でなければならない。${\displaystyle k_{f}}$さらに重要なのは、寿命、${\displaystyle \tau }$これは初期強度や放出光に依存しない。この特性は化学センシングにおける強度に基づかない測定に利用できる。^{[ 5 ]}

蛍光寿命イメージングでは、各ピクセルの強度が以下のように決定される画像が得られます。${\displaystyle \tau }$これにより、蛍光減衰速度が異なる材料間のコントラストを観察することができ（たとえそれらの材料がまったく同じ波長で蛍光を発する場合でも）、 FRETイメージングなどの他の減衰経路の変化を示す画像も生成できます。

解析アルゴリズムの目標は、測定された減衰から純粋な減衰曲線を抽出し、寿命を推定することです。後者は通常、単一または多重指数関数をフィッティングすることによって達成されます。この問題を解決するために、さまざまな方法が開発されてきました。最も広く使用されている手法は、残差の重み付き和の最小化に基づく最小二乗反復再畳み込みです。この手法では、理論的な指数減衰曲線が、別途測定される機器応答関数と畳み込まれ、最小値が見つかるまでさまざまな入力に対する残差の反復計算によって最適なフィッティングが見つかります。一連の観測に対して、${\displaystyle d({{t}_{i}})}$ 時間ビン i における蛍光信号の寿命推定は、以下の式を最小化することによって行われます。

${\displaystyle {{\chi }^{2}}=\sum \limits _{i}{{\left[{{d}_{i}}({{t}_{i}})-{{d}_{0i}}({{t}_{i}},a,\tau )\right]}^{2}}}$

波長依存の機器応答関数を含む実験上の困難に加えて、反復デコンボリューション問題の数学的処理は容易ではなく、処理速度も遅いため、FLIMの初期にはピクセルごとの解析には実用的ではありませんでした。非フィッティング法は、寿命推定に非常に高速なソリューションを提供するため魅力的です。このカテゴリーにおける主要かつ簡便な手法の1つが、高速寿命決定（RLD）法です。RLDは、減衰曲線を等しい幅の2つの部分に分割することにより、寿命とその振幅を直接計算します。 ${\displaystyle \delta }$t. 解析は、減衰曲線を等間隔の時間で積分することによって行われます。${\displaystyle \delta }$t:

${\displaystyle {\begin{matrix}{{D}_{0}}=\sum \limits _{i=1}^{K/2}{{{I}_{i}}\delta t}&{{D}_{1}}=\sum \limits _{i=K/2}^{K}{{{I}_{i}}\delta t}\\\end{matrix}}}$

Iiはi番目のチャネルで記録された信号であり、Kはチャネル数である。寿命は以下を用いて推定できる。

${\displaystyle \tau =\delta t/\ln({{D}_{0}}/{{D}_{1}})}$

多重指数関数的減衰の場合、この式は平均寿命を示します。この方法は二重指数関数的減衰の解析にも拡張できます。この方法の大きな欠点の1つは、測定機器の応答効果を考慮できないことです。そのため、測定された減衰曲線の初期部分は解析において無視する必要があります。これは、信号の一部が破棄されることを意味し、短い寿命を推定する精度が低下します。

畳み込み定理の興味深い特徴の一つは、畳み込みの積分が、その積分を構成する因子の積になることです。変換空間で機能するいくつかの手法は、この性質を利用して、測定された曲線から純粋な減衰曲線を復元します。ラプラス変換とフーリエ変換、およびラゲール・ガウス展開は、変換空間での寿命を推定するために使用されてきました。これらのアプローチは、逆畳み込みに基づく方法よりも高速ですが、切り捨てとサンプリングの問題を抱えています。さらに、ラゲール・ガウス展開のような方法の適用は、数学的に複雑です。フーリエ法では、単一の指数減衰曲線の寿命は次のように与えられます。

${\displaystyle \tau ={\frac {1}{n\omega }}{\frac {{A}_{n}}{{B}_{n}}}}$

どこ：

${\displaystyle {\begin{matrix}{{A}_{n}}={\frac {\sum \limits _{t}{d(t)\sin(n\omega t)}}{\sum \limits _{t}{IRF(t)\sin(n\omega t)}}}={\frac {\omega \tau }{1+{{\omega }^{2}}{{\tau }^{2}}}},&{{B}_{n}}={\frac {\sum \limits _{t}{d(t)\cos(n\omega t)}}{\sum \limits _{t}{IRF\cos(n\omega t)}}}={\frac {1}{1+n{{\omega }^{2}}{{\tau }^{2}}}},&\omega ={\frac {2\pi }{T}}\\\end{matrix}}}$

ここで、nは高調波次数、Tは検出の全時間範囲である。

FLIMは、生物学において、細胞や腫瘍中の光増感剤の検出法として、また比率測定イメージングが困難な場合のFRET法として主に用いられてきた。この技術は1980年代後半から1990年代前半にかけて開発され（ゲーティング法：Bugielら 1989、König 1989、^{[ 13 ]}位相変調：Lakowiczら 1992、^{[ 14 ] [ 15 ]}）、1990年代後半に広く応用されるようになった。細胞培養においては、EGF受容体シグナル伝達^{[ 16 ]}や輸送^{[ 17 ]}の研究に用いられてきた。 時間領域FLIM（tdFLIM）は、核膜上の異なるホモポリマーにおける核中間径フィラメントタンパク質であるラミンAとB1の2種類の相互作用を示すためにも用いられており、これらはさらに高次構造で互いに相互作用する。^{[ 18 ]} FLIMイメージングは​​、脳組織による光散乱が比率イメージングに問題となるニューロンにおいて特に有用である。^{[ 19 ]} ニューロンでは、パルス照明を用いたFLIMイメージングがRas、^{[ 20 ]} CaMKII、Rac、およびRan ^{[ 21 ]}ファミリータンパク質の研究に用いられてきた。FLIMは、臨床多光子断層撮影において、皮内癌細胞や医薬品および化粧品化合物の検出に用いられてきた。

最近では、FLIMは植物細胞中のフラバノールを検出するためにも使用されている。 ^{[ 22 ]}

• 蛍光寿命とスペクトルイメージングへのフェーザーアプローチ

• 蛍光励起状態寿命イメージング
• ImageJの寿命およびスペクトル解析ツール：http://specron.com Wayback Machineに2013年3月11日にアーカイブ済み
• 蛍光寿命イメージング顕微鏡
• TCSPC FLIMの原理（Becker&Hickl GmbH）