マイクロスケール熱泳動

マイクロスケール熱泳動（MST）は、生体分子間の相互作用を生物物理学的に解析するための技術です。マイクロスケール熱泳動は、非蛍光性リガンドの濃度に応じて、標的の蛍光の温度誘起変化を検出することに基づいています。観察される蛍光変化は、2つの異なる効果に基づいています。1つは、蛍光プローブの温度関連強度変化（TRIC）に基づくもので、これは結合イベントによって影響を受ける可能性があります。もう1つは、熱泳動、つまり微小な温度勾配における粒子の方向性のある移動に基づくものです。蛍光プローブの化学的微小環境の変化、および生体分子の水和殻の変化は、温度勾配を適用したときに検出される蛍光の相対的な変化をもたらし、結合親和性を決定するために使用できます。MSTは、表面への固定化を必要とせずに、溶液中で直接相互作用を測定することを可能にします（固定化不要技術）。

アプリケーション

親和性

タンパク質、DNA、^[²^] RNA、^[³^]ペプチド、 [4]小分子、 ^[⁵^]フラグメント、^[⁶^]およびイオン^を含むあらゆる種類の生体分子^{[ 1 ]}^の間^で
高分子量複合体、大きな分子集合体、さらにはリポソーム^{[ 7 ]} 、小胞、ナノディスク^{[ 8 ]} 、ナノ粒子^{[ 9 ]}、ウイルスとの相互作用の場合
血清や細胞溶解液を含むあらゆる緩衝液中^{[ 4 ]}
競合実験（例えば、基質と阻害剤を用いた実験）において

熱力学的パラメータ

MSTは、生体分子相互作用へのエンタルピー的およびエントロピー的寄与を推定するために使用されてきた。^{[ 10 ]}

追加情報

試料の特性（均一性、凝集性、安定性）
複数の結合部位、協調性

テクノロジー

MSTは、温度変化を加えたときのサンプル中の蛍光変化を定量的に検出することに基づいています。ターゲット分子の蛍光は、外因性または内因性（芳香族アミノ酸）であり、2つの異なる効果により温度勾配で変化します。一方では、温度に関連した強度変化（TRIC）があり、これは蛍光体の固有の特性である、温度の関数として蛍光強度が変化することを示しています。蛍光強度の変化の程度は、蛍光プローブの化学的環境によって影響を受け、これは、コンフォメーション変化またはリガンドの近接による結合イベントで変化する可能性があります。^{[ 11 ]}^{[ 12 ]}他方では、MSTは、温度勾配に沿った分子の方向性のある移動、熱泳動と呼ばれる効果にも基づいています。空間的な温度差ΔTは、高温領域の分子濃度の変化につながり、これはソレー係数S _Tによって定量化されます。c _hot /c _cold = exp(-S _T ΔT)。^{[ 13 ]}^{[ 14 ]} TRICと熱泳動の両方が、MST測定で記録される信号に次のように寄与します。∂/∂T(cF)=c∂F/∂T+F∂c/∂T。この式の最初の項c∂F/∂Tは、温度(T)の関数としての蛍光強度(F)の変化としてTRICを表し、2番目の項F∂c/∂Tは、温度の関数としての粒子濃度(c)の変化として熱泳動を表します。熱泳動は、分子と溶媒の界面に依存します。一定の緩衝液条件下では、熱泳動は分子のサイズ、電荷、および溶媒和エントロピーを調べます。蛍光標識された分子Aの熱泳動は、サイズ、電荷、および溶媒和エントロピーの違いにより、通常、分子-標的複合体ATの熱泳動とは大きく異なります。この分子の熱泳動特性の違いは、一定の緩衝液条件下での滴定実験において結合量を定量化するために利用される。

蛍光標識分子の熱泳動は、毛細管内の蛍光分布 F をモニタリングすることによって測定されます。微視的な温度勾配は、毛細管内に集光され、水に強く吸収される赤外線レーザーによって生成されます。レーザースポット内の水溶液の温度は ΔT = 1 ～ 10 K 上昇します。赤外線レーザーをオンにする前は、毛細管内に均一な蛍光分布 F _coldが観察されます。赤外線レーザーをオンにすると、同じ時間スケールで 2 つの効果が発生し、新しい蛍光分布 F _hotに寄与します。熱緩和により、温度ジャンプに対する局所的な環境依存応答 (TRIC) により、色素の蛍光が結合依存的に低下します。同時に、分子は通常、局所的に加熱された領域から外側の低温領域に移動します。加熱された領域では、分子の局所濃度が定常状態の分布に達するまで減少します。

質量拡散D が枯渇の速度論を決定する一方で、S _{T は}温度上昇 ΔT の下で定常状態の濃度比 c _hot /c _cold =exp(-S _T ΔT) ≈ 1-S _{T ΔT を決定します。正規化蛍光 F}_norm =F _hot /F _{cold は}、TRIC ∂F/∂T に加えて、主にこの濃度比を測定します。線形近似では、F _norm =1+(∂F/∂TS _T )ΔT となります。蛍光強度と熱泳動による枯渇の線形性により、非結合分子の正規化蛍光 F _norm (A) と結合複合体の F _norm (AT) は線形に重ね合わされます。標的に結合した分子の割合を x とすると、標的 T の滴定中の変化する蛍光信号は、F _norm =(1-x) F _norm (A)+x F _norm (AT) で与えられます。^{[ 11 ]}

結合基質の連続希釈を用いて定量的結合パラメータが得られる。希釈系列の異なる濃度の対数に対して F_{ノルムをプロットすると、シグモイド結合曲線が得られる。この結合曲線は、}質量作用の法則の非線形解に直接フィッティングすることができ、その結果として解離定数K _Dが得られる。^{[ 15 ]}^{[ 16 ]}^{[ 17 ]}

参考文献

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アプリケーション

親和性

熱力学的パラメータ

追加情報

テクノロジー

参考文献

関連するトピック

生体分子

物理学的に

熱泳動

温度勾配